肝癌患者外周血AFPmRNA的定性及定量检测与转移的关系

癌症 2000年第6期第19卷 临床研究

作者：刘迎娣　梁敏　孙晓华　程留芳　汪鸿志

单位：刘迎娣　梁敏　孙晓华　程留芳　汪鸿志（解放军总医院消化科,北京100853）

关键词：肝肿瘤；转移；甲胎蛋白；mRNA；竞争PCR

　　【摘要】目的：探讨肝癌患者外周血AFPmRNA的表达与肝癌转移的关系。方法：采用RT-NestedPCR技术,检测了96例患者外周血中的AFPmRNA，并采用竞争PCR技术对其47例阳性患者AFPmRNA的含量进行了检测。结果：AFPmRNA阳性率分别为：对照组0，肝硬化组13.3％,肝癌未发生转移组42.9％,局部转移组（肝内、门脉及胆管癌栓）61.5％，远处转移组90.9％。肿瘤直径≥5cm组AFPmRNA阳性率高于肿瘤＜5cm组（P＜0.01)；血清AFP≥400ng/ml组AFPmRNA阳性率高于＜400ng/ml组（P＜0.01)；AFPmRNA阳性率与Child分级无关（P＞0.05)。阳性患者外周血中AFPmRNA含量分别为：肝硬化组(5.5×10⁴±4.5×10⁴)copies/ml,肝癌未发生转移(1.90×10⁶±1.02×10⁶)copies/ml,局部转移组(2.58×10⁶±2.31×10⁶)copies/ml,远处转移组(2.98×10⁷±2.08×10⁶)copies/ml。其中非肝癌组与肝癌组之间、肝癌无远处转移与远处转移组之间具有显著性差异(P＜0.001)。结论：人外周血中AFPmRNA的检测是判断肝癌发生转移与否的可靠实验方法，对于预测肝癌远处转移的危险性有重要临床意义。

　　中图分类号：R735.7　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X(2000)06－0569－03

The relationship between AFP mRNA concentration in peripheral blood

　　and tumor metastasis in patients with hepatocellular carcinoma

LIU Ying-di, LIANG Min, SUN Xiao-hua, et al.

　　Department of Gastroenterology,General Hospital of PLA,Beijing 100853， P.R. China

　　【 Abstrat】 Objective: To investigate the relationship between AFP mRNA concentration in peripheral blood in patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and tumor metastasis. Methord: 96 cases were included.The AFP mRNA concentration in peripheral blood were determined using RT－ Nested PCR, and compitative RT－ PCR technique were used in quatitative analysis for 47 positive cases. Results:The positive ratio was: control group 0， liver cirrhosis 13.3％ ， HCC without metastasis group 42.9％ ， HCC with local metastasis group 61.5％ ， HCC with distant metastasis 90.9％ .The results showed that significant differences between non-malignant and malignant group; HCC without distant metastasis and with distant metastasis group (P＜ 0.01). The presence of AFP mRNA seemed to be correlated with diameter of tumor and serum AFP value. The AFP mRNA concentrations in the positive were:liver cirrhosis group (5.5× 10⁴± 4.5× 10⁴)copies/ml,HCC without metastasis group (1.90× 10⁶± 1.02× 10⁶) copies/ml,HCC with local metastasis group (2.58×10⁶± 2.31× 10⁶) copies/ml, HCC with distant metastasis (2.98× 10⁷± 2.08× 10⁶) copies/ml. Significant differences were also found between non-malignant and malignant group; HCC without distant metastasis and with distant metastasis group (P＜ 0.01). Conclusions: The detection of human AFP mRNA is very important in clinical prediction of HCC metastasis.

　　Key words:Liver neoplasms;Metastasis;α － fetoprotein; mRNA; Competative PCR

　　肝癌发生肝外转移是影响预后的重要因素之一。过去凭借影像学来发现转移灶，往往已失去有利的治疗时机。部分生化指标如AFP的变化也只能大致预测手术及其它常规治疗后复发的可能，而对是否发生转移则没有意义。血行转移是肝癌发生转移的主要途径,近年来对外周血中AFPmRNA的检测，反映了血中肝癌细胞的存在，为预测肝癌的转移提供了新的方法。本实验采用PCR法定性、定量检测了人外周血AFPmRNA的表达,并探讨其与肝癌转移的关系。

　　1　资料和方法

　　1.1病例及细胞系的选择

　　本研究病例选自1996年10月至1999年6月我科住院患者96例，按疾病种类分为3组：无肝病对照组12例，肝硬化组15例及肝癌组69例，肝癌组又按有无转移分为无转移的肝癌1组、有局部转移的肝癌2组以及伴有远处转移的肝癌3组。肝癌组均经血清学检查、B型超声、CT、病理等检查确诊。采用人类肝癌细胞系HepG₂作为检测结果阳性对照，人类胃癌细胞系BGS－180作为阴性对照。

　　1.2试验方法

　　标本采集、总RNA提取、反转录cDNA均参照文献^[1]。

　　1.2.1引物设计:参考文献^[2]及Oligo引物设计软件设计引物顺序见表1；其中突变引物中引入了G－A，C－T的突变位点，从而使竞争模板中引入了AAGCTT的HindⅢ酶切位点。

　　1.2.2定性检测：分别采用外引物A和B、内引物C和D进行巢式PCR反应，全部标本检测均在β₂微球蛋白阳性、HepG₂细胞系AFPmRNA阳性、BGS－180细胞系阴性基础上进行。反应终产物长度为184bp。琼脂糖电泳后在紫外透射仪下观察结果。

　　1.2.3模板制备:取AFPmRNA定性呈阳性的肝癌组织提取总RNA,反转录成cDNA,利用以下引物进行PCR反应:①A和B;②A和F,B和E。分别将②产物提纯,加入引物A、B再次进行PCR,即制备出模板，分光光度计测量其OD值，并计算其浓度。模板AFPmRNA含量公式为：(OD值×50×50×6.02×1023)/(649×357×1000×1000×1000)opies/μl。此模板已引入HindⅢ酶切位点,其竞争PCR产物经酶切后与标本产物进行对比。

　　1.2.4巢式PCR:模板作10倍倍比稀释,与待测标本于一个反应体系里进行PCR。分别用外引物A和B与内引物C和D行PCR反应,第一次PCR反应体系容积50μl,其中含50mmol/LTris－HCl(pH8.3)，44mmol/LKCl，1.1mmol/LMgCl2，0.013％明胶,各12.5pmol外引物、TaqDNA酶2.5u。95℃预变性5min,93℃变性60s，50℃复性60s，72℃延伸120s,共进行32循环,后延伸10min,扩增片断长度为357bp。第二次PCR:取第一次扩增产物2μl,加入第二次反应体系中,除引物为内引物外，其余与第一次相同。扩增片断长度为184bp。

　　1.2.5酶切反应:取第二次PCR产物10μl，10×酶切缓冲液2μl，HindⅢ酶15U,混匀，37℃4h，75℃10min,酶切产物长度分别为90bp和94bp。

　　1.2.6电泳及结果观察：2.0％琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,以pBR322/Hinf1作为分子量标准,在紫外透射下观察结果，以条带亮度最接近的模板浓度的2倍作为待测标本浓度。

　　1.3　统计学方法及显著性界值

　　采用χ²检验及t检验,以P＜0.05为显著性差异界值,以P＜0.01为非常显著性差异界值。

　　2　结果

　　AFPmRNA定性检测结果如表2。实验结果显示，AFPmRNA的阳性率随对照组、肝硬化组、肝癌未转移组、局部转移组和远处转移组顺序递增。经统计学处理非肝癌组（2/27）与肝癌组（45/69）之间、有远处转移组（20/22）与无远处转移组（25/47）之间差异均有显著性意义（P＜0.01）；按肿瘤大小及AFP≥400ng/ml与否及Child分级，则肿瘤直径≥5cm组，其AFPmRNA的阳性率（36/45）与＜5cm组（9/23）之间具有显著性差异（P＜0.01)；按肝功能的Child分级分组，AFP≥400ng/ml组其阳性率（35/45）与AFP＜400ng/ml组（8/24）之间具有显著性差异（P＜0.01）；不同组之间阳性率无显著性差异（P＞0.05）。同一肿瘤分组中，肿瘤直径≥5cm组，其AFPmRNA的阳性率与＜5cm组之间除肝癌无转移组外均具有显著性差异（P＜0.05)；AFP≥400ng/ml组其阳性率与AFP＜400ng/ml组之间具有显著性差异（P＜0.01）；按肝功能的Child分级分组，不同组之间阳性率无显著性差异（P＞0.05）。

表1　AEPmRNA引物序列

表2　病例分组及临床特点(n)

　　注:肝癌1组:肝癌未发生转移组;肝癌2组:肝癌发生肝内及局部转移组;肝癌3组:肝癌发生远处转移组;＊P＜0.05分组

表3各组AFPmRNA检测结果(copies/ml)

　　注:表中含量均为阳性患者平均含量;＊P＜0.001　　AFPmRNA定量检测结果如表3。肝癌与非肝癌之间、发生远处转移与未发生远处转移组AFPmRNA含量之间具有非常显著性差异（P＜0.01）；肝癌1组与肝癌2组之间无显著性差异（P＞0.05）。

　　3　讨论

　　本实验结果显示，AFPmRNA的阳性率随对照组、肝硬化组、肝癌未转移组、局部转移组、远处转移组顺序递增。经统计学处理非肝癌组与肝癌组之间、有远处转移组与无远处转移组之间有显著性差异，说明AFPmRNA作为一种敏感的指标，对肝癌远处转移的诊断具有非常重要的临床意义。分析AFPmRNA与肿瘤大小、血清AFP水平之间，以及与肝细胞功能状态关系的结果，本文认为随着肿瘤细胞数量增多、体积增大，分泌AFP入血增多,肝癌细胞脱落入血的机会增加，血中AFPmRNA含量发生变化，发生转移的机会也随之明显增多，因此AFPmRNA可能是预示转移机会增加的一个标志。提示临床对于检测到外周血AFPmRNA表达、肿瘤直径≥5cm、血清AFP≥400ng/ml的患者，要密切注意有无远处转移的发生。

　　本研究在定性检测呈阳性后采用竞争PCR技术检测了外周血AFPmRNA的含量。其中模板的设计不但引进了HindⅢ酶切位点，还将此位点设计于内引物中点附近，目的是使酶切后产物电泳位于同一条带，易于与未酶切之标本进行比较，结果更加可靠，这在以往文献中未见报道。

　　在定性检测的基础上,我们运用竞争PCR技术对47例阳性患者外周血AFPmRNA进行定量检测,以期从含量上判断肝癌发生转移的危险性。从实验结果可以看出，无肝病对照组均为阴性；肝硬化组15例只有2例为阳性，且含量低；AFPmRNA的阳性率及含量随未转移、局部转移及远处转移顺序而提高。非肝癌组与肝癌组AFPmRNA含量之间、发生远处转移与未发生远处转移含量之间也具有非常显著性差异（P＜0.01）。说明肝癌患者发生远处转移的危险性随外周血AFPmRNA的含量增加而增加。我们认为其最重要的临床意义在于：在外周血中检测到AFPmRNA、特别是含量较高或进行性增高时，①要进行进一步检查，早日发现或排除、防止和/或减缓转移的发生；②要特别注意有无远处转移，这对于肝移植、以及肝癌切除术方案的制定及预后的估计都具有重要意义。总之，本研究肝癌患者外周血AFPmRNA的定性及定量检测证实了外周血AFPmRNA与肝癌转移的关系，对临床预测转移及治疗具有重要的指导意义。肝癌患者各种治疗前后外周血中AFPmRNA含量的变化及其与预后的关系正在进一步研究中。

　　基金项目：本课题受军队“九五”科研基金（编号96Q105）资助

　　[参考文献]

　　1，Simms D, Cizdzidl PE, Chomczynski P. TRIzolTM: a new regent for optimal single- step isolation of RNA [J]. Focus , 1993,15:99～ 102.

　　2，Niwa Y, Matsumura M, Shiratori Y, et al. Quantitation of alpha- fetoprotein and albumin messenger RNA in human hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 1996, 23 (6):1384～ 1392.

　　3，Yamamoto H, Itoh F, Sakamoto H, et al. Association of reduced cell adhesion regulator messenger RNA expression with tumor progression in human hepatocellular carcinoma [J] . Int J Cancer, 1997,74(3): 251～ 254.

　　4，Yamanaka N, Okamoto E, Fujihara S , et al. Do the tumor cells of hepatocellular carcinomas dislodge into the portal venous stream during hepatic resection? [J]. Cancer, 1992,70(9):2263～ 2267.

收稿日期：1999－11－12；修回日期：1999－12－23