GGT异常表达机制及定量HS-GGT诊断肝癌临床价值的研究

中国肿瘤临床 2000年第3期第27卷 论　著

作者：姚登福　于志坚　蒋道荣　茅国新　吴信华　孟宪镛

单位：姚登福(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)；于志坚(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)；蒋道荣(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)；茅国新(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)；吴信华(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)；孟宪镛(南通医学院附属医院内科　江苏省南通市　226001)

关键词：肝癌；GGT基因；RT-PCR；甲基化；定量分析

　　摘要　目的：　探讨γ-谷氨酰转移酶(GGT)在肝癌中的表达机制及其定量分析肝癌特异性GGT(HS-GGT)的临床价值。方法：从肝癌组织中纯化总RNA, 以RT-PCR扩增GGT基因并分析M3位点甲基化状态,制备酶蛋白观察不同分子形式GGT的表达与改变,并定量检测了不同肝病患者血清HS-GGT水平。结果：人肝癌至远癌组织中总RNA浓度呈明显升高趋势(P＜0.05),GGT基因检出率分别为100%、85%和75%,而M3位点呈低甲基化状态，其频率分别为75%、55%和50%;癌组织中GGT过度表达,血清HS-GGT活性在肝癌组明显升高,以高于5.5U/L为界诊断肝癌的阳性率为86%,而在其他患者中的阳性率低于3%。结论：基因甲基化状态降低导致GGT异常表达,定量分析HS-GGT有助于肝癌的诊断与鉴别。

Abnormal Expression Mechanisms of γ-glutamyl Transferase and

　　Clinical Value of Quantitative Analysis of Its Hepatoma Specific Bands

Yao Dengfu　Yu Zhijian　Jiang Daorong

　　（Affiliated Hospital, Nantong Medical College, Jiangsu 226001）

　　Abstract　Objective　To explore the expression mechanisms of γ-glutamyl transferase (GGT) and clinical value of quantitative analysis of hepatoma specific GGT (HS-GGT) in hepatocellular carcinomas (HCC).Methods　Total RNAs were extracted, amplified by using a RT-PCR assay, analyzed on methylation status of M3 site, and the GGT proteins were purified and activities of GGT with different molecular form were examined in hepatoma tissues. The levels of HS-GGT were quantitatively analyzed in sera of patients with liver diseases.Results　From liver cancer to distal cancerous tissues, an increasing tendency (p＜0.05) of total RNA concentrations was found; The frequencies of amplified fragment and hypomethylated M3 site of GGT genes were 100% and 75% in HCCs, 85% and 55% in adjacent cancerous, and 75% and 50% in distal cancerous tissues, respectively. The GGTs in hepatomas were overexpressed and the activities of serum HS-GGTs were significantly elevated in HCC patients, the incidence of HS-GGTs over 5.5 U/L was 86% in HCC patients and less than 3% in patients with other diseases.Conclusions　The present data suggest that abnormal expression of GGT proteins in HCC was related to hypomethylation status of GGT genes, the quantitative analysis of HS-GGTs is a useful assay for diagnosis and differentiation of HCC.

　　Key words　Hepatoma, GGT Gene, RT-PCR, Methylation, Quantitative Analysis

　　人类γ-谷氨酰转移酶(GGT)在胎肝中活性甚高，出生后迅速降至较低水平,肝癌发生时又重新表达,并出现诊断肝癌特异的酶区带(Ⅰ'、Ⅱ和Ⅱ'，HS-GGT),但肝癌发生时GGT为何异常表达,其机制尚不清楚^［1,2］。本文以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增了人肝癌、癌周和远癌组织中酶5'-末端非编码区基因片段,采用限制性内切酶分析了CCGG位点的甲基化状态,并定量了肝癌患者血清中HS-GGT活性,以探讨其表达机制及诊断肝癌的价值。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　按自身对照原则留取肝癌(HCC)、癌周及远癌组织各20份(约200mg)，除作病理学检查外,其余于-85℃保存。其中男15例,女5例；平均50.8岁。肿瘤直径＞3cm16例，＜3cm4例；12例AFP＞50ng/ml，8例＜50ng/ml。同时对住院患者(肝癌156例,急性肝炎39例,慢性肝炎72例,肝硬化75例)、肝外肿瘤(手术证实胆管癌3例,胰腺癌4例,胃癌5例,结肠癌5例，乳腺癌2例)及正常献血员血清60份作HS-GGT定量分析。肝炎按全国第五届传染病及寄生虫病会议，肝癌按南宁肝癌研究协作会议标准核实诊断。

　　1.2　总RNA制备与RT-PCR分析

　　取癌组织50mg以RNA快速制备试剂(Gibco, BRL)，提取总RNA并测其浓度^［3］。按肝癌细胞株GGT核苷酸序列,在5'-NC区设计引物(中科院上海细胞所合成,表1)。总RNA经随机引物(Promega)和逆转录酶(Gibco)合成GGT-cDNA，于DNA扩增仪上扩增(35循环/次)。先以外部引物和cDNA为模板,扩增产物为400bp(含CCGG位点);再以此为模板,内部引物进行扩增,其终产物280bp经2%琼脂糖凝胶电泳和紫外光照射,并与DNA标准物质比较判别结果。

表1　GGT引物寡核苷酸序列、名称、位置、产物和甲基化位点数

　　 1.3　GGT基因甲基化状态分析

　　取第一次PCR产物5μl,加入HapⅡ10U与双倍体积缓冲液于37℃4小时,经2%琼脂糖电泳和紫外光照射,与DNA标准比较判别M3位点甲基化状态：若见与原设计一致322bp和78bp片段,为该位点未甲基化;仍见400bp系酶不能消化,表明位点已甲基化;如无特异性片段出现,则表示该法不能扩增此基因片段。

　　1.4　酶蛋白制备与活性分析

　　取湿重组织50mg两份,以含和无Triton X-100的Tris-HCl匀浆液,置冰水浴中研碎后于4℃过夜,经高速冷冻离心留上清液。总GGT和可溶性GGT以对硝基苯胺直接法分析,以酚试剂法测蛋白浓度(g/L),计算总GGT、膜结合和可溶性GGT比活性(U/g)。HS-GGT先以阶段梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，再以分光光度法定量^［4］并以放射免疫法(RIA)分析血清AFP浓度。

　　1.5　资料统计和分析

　　用方差分析、X²检验等分析处理数据,并以χ±s表示结果和进行两两比较。

　　2　结果

　　2.1　病理学检查及总RNA浓度变化

　　病理学H.E染色检查证实20例癌组织系肝细胞性肝癌(HCC)。癌旁组织中肝硬化17例、慢性肝炎3例、伴不典型增生16例;远癌组织中肝硬化11例,慢性肝炎9例,伴不典型增生11例；地衣红染色HBV阳性17例。20例癌、癌周和远癌组织总RNA浓度,分别为21.1±30.8、40.0±31.5、53.8±50.5μg/mg湿重肝组织,组间差别均有显著性(P＜0.05)。

　　2.2　酶基因扩增与甲基化状态

　　癌组织GGT基因5'-NC区扩增出现280bp,与原设计完全吻合且图谱清晰(附图)。在癌、癌周和远癌组的阳性率分别为100%(20/20)、85%(17/20)和75%(15/20)，其中有8份标本未见阳性区带(癌周组:肝硬化2例,慢性肝炎1例;远癌组:肝硬化2例,慢性肝炎3例)。癌、癌周和远癌组GGT基因M3位点,经HapⅡ消化甲基化频度分别为25.0%、30.0%和25.0%;未甲基化频度依次为75.0%、55.0%和50.0%,未见组间差异(P＞0.05),但各组内未甲基化与甲基化例比较差别显著(P＜0.05)。

附图　GGT基因的酶切图谱

　　A：未甲基化； B：已甲基化； C：不能扩增

　　2.3　不同分子形式GGT的表达

　　组织总GGT、可溶性和膜结合性GGT比活性,癌组:100.6±87.4、49.2±53.2和50.9±48.1U/g；癌周组:51.6±21.7、22.5±13.5和29.2±16.3U/g；远癌组:46.6±16.4、22.7±14.3和23.9±11.8U/g。癌组总GGT、可溶性或膜结合性GGT,均非常明显地高于癌周和远癌组水平(P＜0.01)。

　　2.4　血清HS-GGT定量与肝癌诊断

　　不同肝病患者总GGT活性大都异常,肝癌和肝外肿瘤更明显,各组间交叉重叠很大,诊断肝癌缺乏特异性；HS-GGT定量发现肝癌组HS-GGT活性明显升高，肝癌患者86%超过5.5U/L，除肝硬化2例和慢性肝炎2例轻度升高外,其余肝病及肝外肿瘤均低于此值(表2)。术后2周25例患者再检查,HS-GGT已降至0.3～6.4U/L。

表2　肝病患者中HS-GGT定量检测及其比较分析

　　注：与肝癌组比较，*P＜0.05; **P＜0.0012.5　HS-GGT与肿瘤大小及AFP的关系

　　156例肝癌中AFP浓度高于50ng/ml有107例,占68.6%;AFP浓度低于50ng/ml有49例,占31.4%。AFP浓度与HS-GGT活性的关系见表3,在AFP低于50ng/ml组中,有39例HS-GGT活性超过5.5U/L,占总数79.6%。

表3　血清AFP浓度与HS-GGT活性的关系

　　3　讨论　　肝癌是由病毒、化学致癌物等多病因作用以及经启动、促进、演变多阶段的发病过程。因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控,出现持续增殖而致癌变,其中基因状态与调控和表达关系密切^［5］。肝细胞癌变过程中能合成和分泌多种与肝癌相关的蛋白质、多肽或同工酶,如AFP和HS-GGT均是肝癌细胞异常表达的产物。人类GGT胚胎期活性甚高，出生后迅速降至低水平,肝细胞癌变时重新表达,并出现对肝癌定性诊断具有特异性的同工酶区带,但为何异常表达的分子生物学机制尚不清楚。本研究以RT-PCR扩增了GGT的基因片段,分析GGCC位点的甲基化状态，定量检测了肝病患者血清HS-GGT浓度,对HS-GGT在诊断和鉴别诊断肝癌上的价值进行了探讨。

　　GGT基因的5'-NC区含6个CCGG位点,利用HapⅡ能识别并切断未甲基化CCGG序列,可推测扩增片段中M3位点是否甲基化。以人肝癌细胞株GGT基因的序列引物,成功地扩增了人肝癌组织及癌周组织中的GGT基因片段,扩增后的终产物与原设计完全一致，且区带清晰。20例癌组织GGT基因扩增片段检出率为100%,癌周和远癌组分别为85%和75%。对M3位点的酶切分析，发现在肝癌、癌周和远癌组织中M3位点甲基化程度均低于30%,而呈广泛的低甲基化状态，各组内未甲基化例与甲基化例的差别非常显著,提示GGT表达受基因甲基化程度的调节。癌变过程中GGT基因去甲基化^［6］,使已关闭的GGT基因重新活化,再过量表达出GGT引起肝组织和血中酶活性的大幅度升高,在癌组织的不同部分存在着甲基化状态的不均一性。Suzuki等以低甲基化5-杂氮胞嘧啶使鼠5-甲基胞嘧啶含量明显减少^［7］,鼠肝GGT呈过量表达以及鼠肝癌出现,而对照鼠未见异常,说明GGT基因去甲基化与肝癌发生有关^［8］。

　　鼠肝癌模型的研究发现,癌变组织GGT表达接近胎肝的GGT水平,肝癌组织GGT基因所编译的肽链与胎肝GGT酶蛋白相一致,且组织GGT以可溶性GGT和膜结合性GGT两种形式存在^［9］。本研究中癌组织总GGT和不同分子形式的GGT,均非常明显地高于癌周和远癌组，且GGT的表达与总RNA浓度存在着不一致性,癌组总RNA浓度明显低于癌周和远癌组,其机制尚不清楚。对肝癌特异GGT同工酶的定量分析，发现肝癌组HS-GGT活性明显升高;除极少数肝硬化或慢性肝炎患者轻度升高外,其余肝病及肝外肿瘤均在正常范围内(表2);对肝癌诊断特异性为87%,且对总GGT明显升高的肝外肿瘤鉴别也具有临床价值^［4］；肝癌术后HS-GGT活性明显下降,说明HS-GGT来源于肝癌组织,是反映肝细胞癌变的灵敏标志物。

　　HS-GGT与AFP的对照研究发现,在AFP浓度高于50ng/ml的肝癌中,HS-GGT异常率为89.7%；在AFP低于50ng/ml的肝癌中,39例异常，占79.6%。说明HS-GGT的表达与AFP浓度无关,它对AFP高浓度或低浓度肝癌的诊断都具有较高的临床价值。本研究所用癌组织多数伴有HBV感染,合并肝硬化达85%，提示HBV感染仍是肝癌发生的主要病原学因素,近半数患者AFP浓度较低,也说明HS-GGT在诊断肝癌方面优于AFP。随着对GGT基因的深入研究,可望成为监测肝细胞早期癌变的灵敏方法^［10］。

　　基金项目：本文课题受国家教委回国人员（教外135）和江苏省卫生厅重点项目（H9133）基金资助

　　参考文献：

　　1，Countay L, Heisterkamp N, Siest G, et al. Expression of mul-tiple γ-glutamyl transferase genes in man. Biochem J, 1994;297:503～8

　　2，Xu KC, Meng XY, Wu JW, et al. Diagnostic value of serum γ-glutamyl transferase isoenzyme for hepatocellular carcinoma: a 10 year study. Am J Gastroenterol,1992;87: 991～7

　　3，Simms D, Cizdziel PE, Chomczynski P. TRIzolTM: a new rea-gent for optimal single-step isolation of RNA. Focus, 1993;15:99～102

　　4，Yao DF, Huang ZW, Chen SZ, et al. Diagnosis of hepatocellu-lar carcinoma by quantitative detection of hepatoma-specific bands of serum γ-glutamyl transferase. Am J Clin Pathol, 1998;110:743～9

　　5，Okamoto T, Darbouy M, Broullet A, et al. Expression of the rat γ-glutamyl transferase gene from a specific promoter in the small intestine and in hepatoma cells. Biochem, 1994;33: 11536～43

　　6，Baik JH, Griffiths S, Giuili G, et al. DNA methylation patterns of the rat gamma-glutamyl transpeptidase gene in embryonic adult and neoplastic liver.Carcinogenesis,1991;12:1035～9

　　7，Suzuki K, Sugiyama T, Ookawara T, et al. High sensitivity to 5-azacytidine in LEC rats, a strain with a metabolic predisposition to hepatitis and hepatoma:possible in volvement of DNA methylation in the expression of cytochrome p-450 andγ-glutamyl transpeptidase. Biochem Int，1991;23:9～14

　　8，Jennifer L, Connts R, Jay L, et al. Alterations in DNA methy-lation may play a variety of roles in carcinogenesis. Cell, 1995;83:13～5

　　9，姚登福,黄介飞, 孟宪镛, 等. 肝脏癌变过程中GGT及其同工酶的表达与动态变化. 肿瘤, 1995;15:53～7

　　10，Tsutsumi M, Sakamuro D, Takada A, et al. Detection of a uni-que gamma-glutamyl transpeptidase messenger RNA species closely related to the development of hepatocellular carcinoma in humans: a new candidate for early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1996;23 :1093～7

收稿日期：1999-01-08

　　修稿日期：1999-07-21