细胞融合大鼠肝癌疫苗体内治疗和预防作用研究
中国肿瘤临床 2000年第3期第27卷 实验肿瘤
作者：卫立辛 钱卫珠 闫振林 刘彦君 王皓 罗明 赵健 覃林花 施军霞 沈锋 吴孟超 郭亚军
单位：卫立辛(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)；钱卫珠(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)；闫振林(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)；刘彦君（Sidney Kimmel Cancer Center,10835 Altman Row,San Diego,CA92121,USA)；
关键词：肝癌；疫苗；治疗
摘要 目的：观察大鼠BERH-2肝癌细胞与激活B细胞的细胞融合大鼠肝癌疫苗对肿瘤的预防和治疗作用。方法：应用PEG将大鼠BERH-2肝癌细胞与激活B细胞融合，制备细胞融合大鼠肝癌疫苗；部分肝癌疫苗免疫动物前经60Co照射；大鼠被肝癌疫苗免疫之前或之后，接种肝癌BERH-2细胞或组织块，观察疫苗对肝癌的预防和治疗作用。结果：经细胞融合疫苗保护的大鼠可获100%无瘤生存(8/8)，而HERH-2或照射后BERH-2对照组大鼠均生长肿瘤死亡(0/8)。经皮下接种细胞融合肝癌疫苗治疗大鼠，肝内注射肝癌细胞的大鼠可获85%以上无瘤存活。照射后细胞融合肝癌疫苗与未照射的获得同样治疗效果。不经筛选的细胞融合疫苗也获相同治疗效果，而对照组大鼠均生长肿瘤后死亡。结论：细胞融合肝癌疫苗对大鼠有预防和治疗作用，照射的细胞融合大鼠肝癌疫苗和不经筛选的融合细胞同样具有较好的治疗作用。
Protection and Curative Effect of Cell Fusion Rat Hepatic
Tumor Vaccine
Wei Lixin Qian Weizhu Yan Zhenlin
（Tumor Immunology and Gene Therapy Center，
Second Military Medical University,Shanghai）
Abstract Objective：To investigate the prophylactic and therapeutic effects of hepatoma vaccine generated from rat BERH-2 hepatoma cell fused with activated B cells.Methods：Fusion rat hepatoma vaccine was generated from rat BERH-2 hepatoma cells fused with activated B cells. A part of the hepatoma vaccine cells was irradiated with 60Co before immunization. The rats were inoculated with BERH -2 cells or tissues before or after inoculation of hepatoma vaccine and the prophylactic and therapeutic effects of the vaccine on hepatoma were observed.Results：All the rats under the protection of hepatoma vaccine survived without tumor (8/8), while all the rats in the BERH-2 or irradiated BERH-2 control group succumbed to the tumor with no survival (0/8). Eighty-five percent of the rats inoculated subcutaneously with cell-fusion hepatoma vaccine survived without tumor burden after implantation of hepatoma cells intrahepatically. The irradiated cell-fusion hepatoma vaccine produced the same therapeutic results. The non-selected cell-fusion vaccine also produced the same results. The rats in the control group developed tumors and died within 50 days without any exception.Conclusion：Cell-fusion hepatoma vaccine could produce prophylactic and therapeutic effects in rats. The irradiated cell-fusion rat hepatoma vaccine and the non-selected fused cells could all provide good therapeutic effect.
Key Words
1 材料与方法
1.1 BERH-2大鼠肝癌细胞系［2］
从Wistar大鼠中化学诱发的肝细胞癌，生长迅速，可在同种系动物肝脏内长成实体瘤。B细胞的激活：将牛血清白蛋白与Freunds完全佐剂混合后免疫大鼠，14d后可从其脾脏中分离获得激活的B细胞。将BERH-2细胞与激活的B淋巴细胞以1：10的比例在含有50%不同分子量PEG-1400，1500，2000，4000的无Ca++及Mg++的Dulbeccos PBS中融合不同时间(30秒，45秒，60秒，75秒，90秒)，以兔抗BERH-2血清及兔抗鼠B细胞血清先后对融合后的细胞进行染色，流式细胞仪(FACScan，BD公司)检测双阳性细胞克隆，予以扩增培养。
1.2 细胞融合疫苗的保护实验
3组Wistar大鼠(8只/组)皮下分别注射2×106 BERH-2细胞(对照组)，BERH-2-B细胞或照射过(50Gy)的BERH-2细胞(保护组)。2周后，所有三组动物均肝内注射5×106的BERH-2细胞，观察融合细胞免疫后对大鼠肝癌的预防保护作用。
1.3 细胞融合疫苗的治疗实验
14只大鼠，肝内注射2×107BERH-2细胞，10天后，8只皮下注射5×106BERH-2-B细胞(治疗组)，其余的6只大鼠由皮下注射同样数量的BERH-2细胞(对照组)，观察融合细胞对大鼠肝癌的治疗作用。
在14只大鼠的体内植入小块BERH-2肿瘤(0.3mm×0.5mm)，10天后，8只皮下注射5×106的BERH-2-B杂交瘤细胞，另外6只注射同样数量的BERH-2细胞，进一步证实融合细胞对大鼠肝癌的治疗作用。
1.4 未经筛选细胞融合肝癌疫苗治疗实验
3组大鼠(8只/组)肝内注射5×106BERH-2细胞，10天后，其中一组大鼠皮下注射5×106BERH-2细胞(对照组)，一组注射5×106BERH-2-B杂交瘤细胞(治疗组)，另一组注射5×106经50Gy照射的未经筛选(融合率的30%)的BERH-2-B杂交瘤细胞，观察照射后杂交瘤的作用价值。
2 结果
三组(8只/组)Wistar大鼠(180±10g)皮下分别注射2×106BERH-2细胞，BERH-2-B细胞或照射过(50Gy)的BERH-2细胞。2周后，所有三组大鼠均肝内注射5×106BERH-2细胞。结果以BERH-2-B杂交瘤免疫的大鼠再注射BERH-2亲代细胞，超过150天后大鼠体内仍无肿瘤形成，而大鼠皮下注射BDRH-2或照射BERH-2后再肝内注射BERH-2细胞后，动物仍于50天内死亡(表1)。结果提示：杂交瘤细胞对体内肿瘤的形成具有明显的预防作用。
表1 细胞融合大鼠肝癌疫苗对肝内
注射BERH-2肝癌细胞的保护作用
| 分 组 |
只 |
数存活数* |
| 细胞融合疫苗组 |
8 |
8 |
| BERH-2对照组 |
8 |
0 |
| 照射后BERH-2对照组 |
8 |
0 |
*存活期超过150天。
2.2 细胞融合肝癌疫苗的治疗作用
14只Wistar大鼠(180±10g)，先肝内注射BERH-2肝癌细胞10天后，其中8只大鼠皮下注射5×106BERH-2-B，其余6只大鼠皮下注射相同数量的BERH-2细胞作为对照。其中BERH-2-B治疗组大鼠生存期均超过120天，相反对照组大鼠均在50天内死亡(表2)。
表2 细胞融合肝癌疫苗对肝内
注射BERH-2肝癌细胞的治疗作用
| 分 组 |
只 |
数存活数* |
| 细胞融合疫苗治疗组 |
8 |
8 |
| BERH-2对照组 |
6 |
0 |
*存活时间大于120天。
14只Wistar大鼠(180±10g)，体内植入小块BERH-2肿瘤(0.3mm×0.5mm)，10天后，其中8只在鼠皮下注射5×106BERH-2-B融合细胞，其余6只大鼠皮下注射相同数量的BERH-2细胞作为对照。结果治疗组大鼠除两只生长肿瘤，分别于第71、74天死亡外，其余均存活超过120天，而对照组大鼠则均在注射后50天内死亡(表3)。
表3 细胞融合肝癌疫苗对肝内
接种BERH-2组织块的治疗作用
| 分 组 |
只 |
数存活数* |
| 细胞疫苗治疗组 |
8 |
8 |
| BERH-2对照组 |
6 |
0 |
*存活时间大于120天。
三组(8只/组)Wistar大鼠(180±10g)肝内注射5×106 BERH-2细胞，10天后其中一组大鼠皮下注射5×106BERH-2细胞。一组注射5×106BERH-2-B融合细胞，另一组注射5×106经50Gy照射的BERH-2-B融合细胞。经照射的融合细胞与未照射的融合细胞具有相同的治疗效果，此两组大鼠除1只死亡外，其余7只生存期均超过120天，相反对照组大鼠均在51天内死亡(表4)。
表4 照射后细胞融合肝癌疫苗
对肝内注射BERH-2肝癌细胞的治疗作用
| 分 组 |
只 |
数存活数* |
| 细胞融合疫苗照射后治疗组 |
8 |
7 |
| 未照射细胞融合疫苗治疗组 |
8 |
7 |
| BERH-2对照组 |
8 |
0 |
*存活时间大于120天。
结果表明：不管肿瘤的植入方式如何，融合细胞是否经过照射处理，BERH-2-B融合细胞对肿瘤均有明显的治疗作用。
2.3 不经筛选的融合细胞的抗肿瘤作用
应用不经筛选融合细胞洗涤后直接接种大鼠体内的治疗组，8只大鼠均无瘤生存超120天(治疗组)。而经PEG处理的BERH-2细胞注射大鼠体内或将BERH-2细胞与激活的B细胞直接混合注入动物体内的动物均于50天内生成肿瘤后死亡(表5)。结果表明，只有以融合方法获得的肿瘤细胞与抗原递呈细胞的融合细胞免疫过的动物产生抗肿瘤免疫，而注射单纯混合的两种细胞则不能诱导保护性免疫，注射单纯以PEG处理的BERH-2细胞也不能诱发抗肿瘤免疫。
表5 不经筛选的融合肝癌疫苗
对肝内注射BERH-2肝癌细胞治疗作用
| 分 组 |
只 |
数存活数* |
| 未筛选细胞融合疫苗组 |
8 |
8 |
| BERH-2对照组 |
8 |
0 |
| BERH-2+B细胞简单混合组 |
8 |
0 |
*存活时间大于120天。
3 讨论
机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切的关系。正常机体每天有许多细胞可能发生突变，但并不一定都发展为肿瘤，其机制主要是因为机体通过细胞免疫机制能识别并特异性地杀伤突变细胞，使突变细胞在未形成肿瘤前即被清除。但当突变细胞逃避了机体的免疫监控后，机体滋生肿瘤。肿瘤细胞一般具有肿瘤特异性抗原，当这种抗原在肿瘤细胞内加工并与细胞MHC分子结合以MHC-肽复合物的形式表达在细胞表面后，T细胞受体(TCR)和CD8/CD4能与该MHC-肽复合物结合形成第一信号系统［3，4］。有时第一信号系统并不能有效刺激机体的抗肿瘤细胞免疫，还需辅以共刺激信号(又称第二信号)，共刺激信号主要由细胞表面粘附分子受体配体系统和细胞因子组成，其中肿瘤细胞表面B7分子、ICAM和T细胞表面相应的CD28分子、LFA-1分子是两对最主要的第二信号系统。当机体上述抗肿瘤细胞免疫反应信号系统不完善，如MHC分子、B7、ICAM、CD28和LFA-1等分子中的一种或几种减少甚至缺如时，机体不能实现有效的免疫监控，肿瘤得以发生发展［5，6，7］。增强机体的抗肿瘤细胞免疫功能是当前肿瘤治疗的研究策略之一。
通常以基因修饰法制备的肿瘤疫苗接种机体以增强机体抗肿瘤免疫，但该方法不仅费时，且需攻克许多技术上的难题，如尚需提高基因转染效率和提高基因转染的靶向性，另外，肿瘤细胞常为多基因缺陷，因而单基因修饰的肿瘤细胞往往不能有效的多基因缺陷肿瘤的疫苗。
大鼠肝癌BERH-2细胞和激活B淋巴细胞融合时发现，与融合前亲本细胞相比，融合细胞的MHCⅠ类分子表达增加，MHCⅡ、ICAM-1、LFA-1和B7分子获得表达，表明这种融合细胞不仅可能从亲本肿瘤细胞获得特异性肿瘤抗原，而且能从亲本B细胞获得充足的各种共刺激分子和MHC分子，因而以细胞融合法制备肿瘤疫苗有良好的前景。我们先期以PEG融合法制备了BERH-2细胞和激活B淋巴细胞的细胞融合大鼠肝癌疫苗，开创应用APC制备肿瘤疫苗研究新领域［1］。应用抗原递呈细胞(APC)制备肿瘤疫苗已是当今肿瘤免疫治疗研究的热点之一［8］。APC具有抗原递呈能力，同时细胞表面有大量的共刺激分子。激活B细胞是一种抗原递呈细胞，本实验系统观察了细胞融合肝癌疫苗的预防保护和治疗作用。本实验还观察比较了简单混合的细胞和细胞融合肿瘤疫苗的抗肿瘤效应，大鼠BERH-2肝癌细胞系与激活B细胞的简单混合及单纯BERH-2细胞都能使大鼠生长肿瘤，只有两种细胞融合对大鼠产生保护性抗肿瘤免疫反应，结果提示融合是制备这种疫苗的必要措施。未经筛选的融合细胞也能诱导抗肿瘤免疫，说明了细胞融合法制备的肿瘤不需进一步筛选纯化就有较好的抗肿瘤作用。
基金项目：本文课题受国家自然科学基金重点课题项目资助（批准号：39789010），国家杰出青年科学基金资助（批准号：39725028），上海市卫生局医学领先学科资助
作者单位：王皓（Sidney Kimmel Cancer Center,10835 Altman Row,San Diego,CA92121,USA)
罗明(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
赵健(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
覃林花(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
施军霞(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
沈锋(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科研究所肿瘤免疫和基因治疗中心 上海市 200438)
郭亚军（Sidney Kimmel Cancer Center,10835 Altman Row,San Diego,CA92121,USA)
参考文献：
1，Guo YJ, Wu MC, Chen H, et la. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994;263：518
2，郭亚军、吴孟超、陈 汉，等.大鼠BERH-2肝癌模型的复制及其在肿瘤免疫学研究中的应用.中华实验外科杂志，1989；6：68～70
3，Doyle C, Strominger JL. Interaction between CD4 and class Ⅱ MHC molecules mediated cell adhesion. Nature,1988;330：256～258
4，Norment AM, Salter RD, Parham P, et al. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class Ⅰ molecules. Nature, 1988;336：79～81
5，Chen LP. McGowan P. Ashe S, et al. Tumor immunogenicity detemines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity. J Exp Med, 1994;179：523～532
6，Townsend SE, Allison JP. Tumor rejection after direct costimu-
lation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells. Science, 1993;259：268～270
7，Linsley PS, Lebtter JA. The role of the CD28 receptor during T cell response to antigen. Annu REv Immunol, 1992;11：191～196
8，Schoenberger SP, Jonges LE, Mooijaart RJ, et al. Effecient di
rect priming of tumor-specific cytotoxic T lymphocyte in vivo by an engineered APC. Cancer Res, 1998;58：3094～100
收稿日期：1999-12-08
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