肝癌患者外周血AFPmRNA的定量检测与肝外转移的关系

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著选登

作者：刘迎娣　梁敏　孙晓华　程留芳　汪鸿志

单位：刘迎娣（解放军总医院消化科　北京市100853）；梁敏（解放军总医院消化科　北京市100853）；孙晓华（解放军总医院消化科　北京市100853）；程留芳（解放军总医院消化科　北京市100853）；汪鸿志（解放军总医院消化科　北京市100853）

　　血行转移是肝癌发生转移的主要途径，肝癌细胞脱落入血是发生血行转移的前提。外周血中AFPmRNA的检测，为预测肝癌的转移提供了新的手段。本实验采用反转录竞争PCR法定量检测了人外周血AFPmRNA含量。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例及细胞系的选择

　　选自1996年10月至1998年6月我科住院患者96例。按疾病种类分为3组：无肝病对照组12例，肝硬化组15例及肝 癌组69例。肝癌组均经血清学检查、B型超声、CT、病理等检查确诊。采用人类肝癌细胞系HepG2作为检测结果阳性对照，人类胃癌细胞系作为阴性对照。

　　1.2　试验方法

　　标本采集、总RNA提取、反转录cDNA均参照有关文献进 行。

　　引物设计：参考有关文献及01igo引物设计软件设计引物顺序(表1)。

表1　AFPmRNA引物序列

　　模板制备：取AFPmRNA定性呈阳性的肝癌组织提取总RNA，反转录成cDNA，利用以下引物进行PCR反应：①A和B；②A和 F，B和E；分别将②产物提纯，加入引物A、B再次进行 pCR，即制备出模板。此模板引入HindⅢ酶切位点，其竞 争PCR产物酶切后进行对比。

　　巢式PCR：模板作10倍倍比稀释，与待测标本于一个反应体系里进行PCR。分别用外引物A和B与内引物C和D行 PCR反应，第一次PCR反应体系容积50μl，其中含外引物各12.5pmol、TaqDNA酶2.5单位。95℃预变性5分钟，然后93℃变 性60秒，50℃复性60秒，72℃延伸120秒，共进行32循环，后延伸10分钟，扩增片段长度为357bp。第二次PCR：取第一次扩增产物2μl，加入第二次反应体系中，除引物为内引物外与第一次相同。扩增片段长度为184bp。

　　酶切反应：取第二次PCR产物10μl，10×酶切缓冲液2μl， hindⅢ酶5U，混匀，37℃30分钟，75℃10分钟，酶切产物长度分别为94bp和90bp。

　　电泳及结果观察：2.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，以pBR322/BstN1作为分子量标准，在紫外透射下观察结果，以条带量度最接近的模板数为待测标本浓 度。

　　1.3　统计学方法及显著性界值

　　采用t检验，以P＜0.05为显著性界值，以P＜0.01为非常显著性界值。2　结果

　　AFPmRNA检测结果如表2。

表2　各组AFPmRNA检测结果(拷贝/ml血)

　　注：1)表中含量均为阳性患者平均含量；

　　2)肝癌1组：肝癌未发生转移组；

　　肝癌2组：肝癌发生肝内及局部转移组；

　　肝癌3组：肝癌发生远处转移组；

　　3)*P＜0.0013　小结

　　本研究在定性检测呈阳性后采用竞争PCR技术定量检测外周血AFPmRNA。其中模板的设计参照了有关文献及 01igo引物软件，不但引进了HindⅢ酶切位点，还将此位点设计于内引物中点附近，目的是使酶切后产物电泳位于同一条带，易于与未酶切之标本进行比较，结果更加可靠，这在以往文献中未见报道。

　　我们曾报道不同肝病患者外周血AFPmRNA的定性检测，得出了伴远处转移的肝癌患者AFPmRNA阳性率高于不伴远处转移患者(P＜0.05)的结论。在此基础上，我们采用 竞争PCR技术对外周血AFPmRNA进行定量检测，以期从含量上判断肝癌发生转移的危险性。从实验结果可以看出，无肝病对照组均为阴性；肝硬化组15例只有2例为阳性，且含量低；AFPmRNA的阳性率及含量随未转移、局部转移及远处转移顺序而提高。肝良性病变组与 恶性病变AFPmRNA含量之间、发生远处转移与未发生远处转移含量之间也具有非常显著性差异(P＜0.0001)。说明肝癌患者发生远处转移的危险性随外周血AFPmRNA的含量增加而增加。提示在外周血中检测到AFPmRNA、特别是含量较高时，要特别注意有无远处转移，必要时可进行进一步检查与治疗，防止和(或)减缓转移的 发生。

(李雅玲校对)

　　本文课题受全军九五攻关科研基金资助(编号96Q105)

(1999－12－20收稿)