腺病毒介导人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因在肝癌细胞中的表达

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 基础研究

作者：王征旭　何振平　吴祖泽　张维维

单位：王征旭(第二军医大学东方肝胆外科医院，上海，200438)；何振平（第三军医大学西南医院肝胆外科中心，重庆，400038）；吴祖泽（军事医学科学院放射医学研究所百环生物医学研究中心)；张维维（美国Baxter医疗用品公司基因治疗部)

　　我们以E1、E3区缺失的血清5型腺病毒为载体，构建了同时含人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因的重组腺病毒载体，并研究其在肝癌细胞中的表达。

　　一、材料与方法

　　1.细胞培养和构建单、双顺反子重组腺病毒载体：肝细胞癌细胞系HepG2、BEL7402、SMMC7721，含5型腺病毒E1片段的人胚肾细胞系293细胞，正常人肝细胞系L02和大鼠癌肉瘤Walker256细胞，分别培养于含10%胎牛血清的高糖型DMEM或RPMI 1640中。所有目的基因均被克隆到质粒pXCJL1^［1］中，再与重组质粒pJM17通过脂质体DOTAP介导(Promega)，在293细胞中进行同源重组，构成Ad-multigenes(同时含人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因)^［2］、Ad-p53(仅含人野生型p53抑癌基因)、Ad-GFP(含绿色荧光蛋白标记基因)重组腺病毒载体。

　　2.检测靶细胞对腺病毒的感染效率和目的基因的表达：肝癌细胞感染不同MOI的Ad-GFP后48 h，在荧光倒置显微镜下计数发绿色荧光的细胞数占该视野全部细胞的百分数。3种肝癌细胞感染50 mOI的Ad-multigenes，每24 h收集培养上清，连续收集11 d，用IL-2、GM-CSF定量检测试剂盒(Genzyme公司)，检测IL-2、GM-CSF的表达量。肝癌细胞感染Ad-multigenes后48 h，用FITC标记的B7-1(CD80)鼠抗人单克隆抗体(Pharmingen公司)与靶细胞在室温共同孵育30 min，用流式细胞仪测定细胞表面B7-1的表达水平。肝癌细胞生长于盖玻片上，感染Ad-multigenes后48 h，用SP免疫组化染色法(Zymed公司)检测p53蛋白的表达。

　　二、结果

　　1.肝癌细胞系对腺病毒的感染效率：给予50MOI的Ad-GFP时，3种肝癌细胞系和正常肝细胞系L02均可达到80%～90%左右的感染效率，且随着病毒感染剂量的加大，目的基因的表达水平(发绿色荧光的强度)亦增加。

　　2.目的基因在靶细胞中的表达：3种肝癌细胞系分别感染50MOI的Ad-multigenes后，10⁶细胞每24小时最高可表达约600 ng的GM-CSF，感染后第3天分泌水平最高，以后逐渐下降，到第11天仍可达数十毫微克水平。IL-2的表达水平低于ELISA试剂盒检测范围的下限(＜16 ng/ml)。用p53免疫组化染色，可见HepG2、BEL7402细胞感染Ad-multigenes后48 h，胞核呈棕色；用FACS检测，可见3种肝癌细胞表面B7-1的表达水平均明显增加。以大鼠Walker256细胞做为表达人B7-1蛋白的阴性对照，可见BEL7402、HepG2细胞均弱表达B7-1分子。转染Ad-p53与未转基因的亲本瘤细胞相比，B7-1的表达水平不增加。

　　三、讨论

　　将4种目的基因构建在同一个腺病毒载体上，可保证将几种目的基因同时导入同一个受体细胞，这样可在肿瘤免疫的不同环节发挥免疫增强作用^［3］。4种目的基因由2个启动子启动，其中两目的基因间靠脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite, IRES)相连。结果表明，3种肝细胞癌细胞系及正常肝细胞系L02，均十分易受腺病毒感染^［1］，50MOI的病毒量可使近90%的靶细胞受感染。肝癌细胞感染50MOI的Ad-multigenes后，可持续11 d高水平表达GM-CSF因子，B7-1的表达水平是感染Ad-GFP肝癌细胞或亲本瘤细胞的8倍，同时可见p53蛋白的高水平表达，但IL-2的表达水平极低。

　　参考文献：

　　［1］　Zhang wW, Fang X, Mazur W, et al. high-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenoviurs. Cancer Gene Ther, 1994,1：5-6.

　　［2］　Wang Zhengxu, He Zhengping, Wu Zuze, et al. Effects of adenoviral vector-mediated transduction of human p53, B7-1 and GM-CSF genes on liver cancer cells. J Med Coll PLA, 1999,14：247-257.

　　［3］　王征旭，何振平，吴祖泽.肿瘤基因工程疫苗研究进展.国外医学肿瘤学分册，1998，25：1-3.

收稿日期：1999-03-08