HBxAg增加p53蛋白在肝癌细胞内积聚

　　中华病理学杂志1999年第1期

朱明华　戴益民　詹镕洲

　　摘　要　目的：进一步研究HBVx基因产物HBxAg与p53蛋白的相互关系, 探讨其在原发性肝癌发生中的作用机制。方法：以肝癌细胞株Hep3B为靶细胞, 应用薄层层析法做报道基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)试验与p53和 HBx基因共转染, 并构建了地塞米松诱导表达的HBx基因质粒，用免疫荧光法观察HBxAg表达对细胞内p53蛋白的影响。结果：应用HBx基因与p53和pG13CAT共转染，随HBx量的增加而CAT信号增强，免疫组化显示，当HBxAg与p53蛋白在细胞内结合形成复合物后，p53蛋白进入胞核部分受阻滞，胞浆内p53蛋白含量增加。结论：HBxAg与p53存在蛋白质-蛋白质结合的关系, 使p53蛋白正常的负调节功能降低或失活, 在HBV感染相关的原发性肝癌发生中具有重要意义。

　　关键词：肝肿瘤 肝炎抗原，乙型 基因，抑制，肿瘤 蛋白质p53 基因，p53

　　最近的研究表明，在乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的原发性肝癌(HCC)发生机制中，HBVx基因产物HBxAg起着非常重要的作用^［1］，它可能是通过与肿瘤抑制基因p53相互作用，导致p53基因正常的负调节功能降低或丧失^［2］。研究表明，在HBV感染为主要原因的HCC，p53基因点突变或等位基因丢失的频率远低于以黄曲霉毒素为主因的HCC^［3，4］。我们曾应用免疫沉淀等方法首先报道了HBxAg能与p53蛋白形成复合物，在HCC的发生中具有重要意义^［5，6］，其他实验室也相继证实这一结果^{［2，7，8］}，认为p53基因结构上的变化在HBV相关的HCC中并不是主要原因，而HBxAg与p53蛋白结合，导致p53功能失活与HCC发生关系更为密切^［2］。为进一步研究HBxAg与p53蛋白的相互关系和影响, 我们应用报道基因氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenical acetyltrans ferase assay, CAT)与p53及HBx基因共转染，并构建了由地塞米松诱导表达的HBx基因质粒，观察当HBx表达时对细胞内p53蛋白的影响, 探讨其在HCC发生中的作用机制。

　　材料与方法

　　1．细胞培养：人肝癌细胞株Hep3B和人肺癌细胞株Calu-6(均无内源性p53 mRNA和蛋白质表达)由美国Thomas Jefferson大学人类逆转录病毒中心实验室提供。细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中。

　　2．质粒：pG13CAT由B.Vogelstein博士惠赠^［9］, 该质粒含13个重复的特异性野生型p53（wtp53）应答成分结合序列(5′-CCTGCCTGGACTTGCCTGG-3′)，使CAT基因表达由细胞内p53蛋白水平调控。pCMVwt p53为逆转录病毒载体CMV含wtp53的1.8 kb全长cDNA; pCMVHBx含全长HBx基因, 均由美国Thomas Jefferson大学人类逆转录病毒中心实验室提供。地塞米松诱导表达质粒pMAMHBx的构建, 首先经PCR扩增HBx基因，引物P1：5′-CGCTAGCGCCCATGGCTGCTAGGCTGTAC-3′，P2：5′-CCTCGAGTTAGGCAGAG GTGAAAAAG-3′。扩增片段长476bp。聚合酶链反应（PCR）产物经低溶点琼脂糖凝胶电泳, 纯化, 直接克隆于pT7 Blue (R)载体 (Promega 公司), 选取序列正确的克隆, 经Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点克隆至pMAMneo载体(Clontech 公司), 构建成pMAMHBx质粒(图1)。该质粒的MMTVLT R启动子受地塞米松诱导。

HBx片段（476bp）经Nhe I和Xho I酶切位点克隆至pMAMneo载体，构建成pMAMHBx质粒

　　图1　地塞米松诱导表达质粒pMAMHBx

　　3．基因转染:Hep3B和Calu-6细胞于转染前一天以胰酶处理, 约5×10⁵个单层细胞培养于10cm直径的培养皿。转染前4小时换新鲜培养液。实验分组为2 μg pG13CAT+4 μg pCMVwtp53; 2 μgpG13CAT + 4 μg pCMVwtp53 + 2 μg pCMVHBx或6 μg pCMVHBx, 以pG13CAT或pCMV空载体作对照。转染后48小时收集细胞供CAT试验。地塞米松诱导表达质粒pMAMHBx的转染实验, 以4 μg pG13CAT + 4 μg pCMVwt p53, 分别加2、4、6 μg pMAMHBx, 转染后24小时加入终浓度为4 μmol/L地塞米松, 24小时后收集细胞供CAT试验。基因转染用磷酸钙共沉淀方法, 操作按试剂盒(Promega 公司 )推荐方法进行。每一转染质粒总量以鱼精DNA补足至20 μg。 所有基因转染和下述的CAT实验均重复操作3次。

　　4．CAT试验：CAT试验采用薄层层析法, 简要步骤为: 收集的细胞重悬于0.25 mol/L Tris-HCl中, 反复冻融以裂解细胞；离心取上清50 μl, 加入 CAT反应混合液80 μl (含50 μl 1 mol/L Tris-HCl，10 μl 3.7 MBq/ml［¹⁴C］标记氯霉素，20 μl 3.5 mg/ml乙酰辅酶A)。37℃温育1小时后加1 ml乙酸乙脂, 充分混合后离心, 取900 μl有机相, 真空干燥, 再溶于15 μl乙酸乙酯, 点样于25 mm 薄层层析硅胶板(Sigmag公司), 吹干, 置100 ml氯仿：甲醇(95∶5)于层析缸中层析30分钟, 吹干后做自显影。

　　5．p53蛋白免疫细胞化学染色:分别将转染有pCMVwtp53或pCMVwtp53+pCMVHBx基因质粒的Hep3B和Calu-6细胞, 培养于4孔载玻片内, 细胞贴壁后, 除去培养液, 以冷乙醇∶醋酸(95∶5)于4 ℃固定过夜, PBS洗后加入抗p53蛋白单克隆抗体(pAb1801, Oncogene公司) 37 ℃ 2小时, PBS缓冲液洗后加入羊抗鼠荧光抗体(Sigma公司)室温1小时, PBS缓冲液洗后蛋白-甘油封片, 荧光显微镜观察。在普通光源下计数300个细胞，求出阳性细胞百分比。

　　结　果

　　1．pG13 CAT与pCMVwtp53和pCMVHBx共转染后的CAT结果：以2 μg pG13CAT和4 μg pCMVwtp53共转染，可见CAT表达，加入2 μg pCMVHBx后，CAT信号增强，当pCMVHBx增加至6 μg, CAT信号显著增强(图2)。表明HBx表达增强, 使细胞内p53蛋白含量也相应增加, 表现为CAT表达增强。pCMV空载体或pG13CAT单转染作对照, 未见CAT信号。在pG13CAT+pCMVwtp53转染组,转染后细胞增殖处于停滞状态,可能与wtp53诱导的细胞凋亡有关。

　　1：pCMV空载体，2：pG13CAT，3：2 μg pG13CAT＋4 μg pCMVwtp53，4：在3的基础上加入2 μg pCMVHBx，5：在3的基础上加入6 μg pCMVHBx

　　图2　CAT试验结果2．地塞米松诱导HBx表达的CAT结果:4 μg pG13CAT + 4 μg pCMVwtp53 + 4 μg pMAMHBx共转染, 不加地塞米松诱导, 其CAT信号较弱, 经地塞米松诱导后, CAT表达显著增强(图3)。分别以2μg、4μg、6 μg的 pMAMHBx作共转染, 并以地塞米松诱导, 可见随HBx量的增加而CAT信号增强(图4)。结果与上述基因共转染基本一致, 进一步证明X基因的表达可增加细胞内p53蛋白的积聚。

　　1: 4 μg pG13CAT(下同),2：pG13CAT＋4 μg pCMVwtp53＋4 μg pMAMHBx未经诱导，3：pG13CAT＋4 μg pMAMneo载体，经地塞米松诱导，4：质粒同2，经地塞米松诱导

　　图3　地塞米松诱导HBx表达的CAT试验结果

　1: 同图3，2：pG13CAT＋4 μg pCMVwtp53，3：2＋2 μg pMAMHBx，4：2＋4μg pMAMHBx，5：2＋6μg pMAMHBx

　　图4　不同剂量pMAMHBx转染并诱导后的CAT试验结果

　　3．p53蛋白免疫细胞化学染色结果:pCMVwtp53单转染的Hep3B细胞, 48小时后免疫荧光染色有30％～35%被转染的细胞呈现阳性，p53蛋白主要分布于细胞核, 在pCMVwtp53与pCMVHBx共转染后，大部分细胞胞浆p53染色阳性增强,部分细胞以胞浆染色为主（图5～7）。

　　图5～7　p53蛋白间接法免疫荧光染色结果： 6 μg pCMVwtp53和 4 μg pMAMHBx共转染至Hep 3B细胞,48小时后免疫荧光染色除细胞核阳性外,胞浆也呈阳性　×1 000（图5），6 μg pCMVwtp53和 6 μg pMAMHBx共转染至Hep 3B细胞,免疫荧光染色以细胞浆阳性为主　×1 000（图6），6 μg pCMVwtp53和 6 μg pMAMHBx共转染至Hep 3B细胞,大部分细胞以胞浆阳性为主,部分细胞胞浆和胞核均阳性　×400（图7），图5～7均为间接免疫荧光法

　　讨　论

　　人类约1/2的肿瘤被确定存在p53基因各种类型的突变^［10］, 特别是误义突变, 不仅使p53基因丧失其正常的负调节功能, 且具有癌基因的作用。除了这种基因结构上的变化外,另一种与肿瘤发生关系十分密切的变化为，通过与某些肿瘤病毒蛋白结合, 形成蛋白质-蛋白质复合物, 使p53基因的正常功能失活, 如SV40的大T抗原, 腺病毒的E1B, HPV的E6以及EB病毒的核抗原EBNA-5。 自发现HBxAg能与p53蛋白形成复合物后^［5，6］, HBV成为第5个病毒编码产物能与p53蛋白结合的DNA病毒^［2，8］, 这种结合所产生的生物学功能, 及其在HCC发生中的作用机制尚不十分清楚。我们在以前的研究基础上, 应用由细胞内p53蛋白水平调控的报道基因CAT质粒pG13CAT，与HBx和p53基因作共转染，结果表明当增加HBx的量时，CAT信号逐渐增强，应用地塞米松可诱导的重组质粒pMAMHBx，当诱导HBx表达时，CAT信号亦增强，表明HBx表达可增加p53蛋白在细胞的含量，使CAT信号增强。HBxAg与p53以结合形成复合物的形式使p53蛋白在细胞内积聚的现象也见于Ueda等^［2］和Takada等^［11］的研究结果。除了人的HBxAg可与p53蛋白结合外，此种现象也存在于WHVxAg与p53的关系中^［12］。免疫细胞化学结果显示，当p53蛋白与HBxAg形成复合物后，p53蛋白在胞浆内的含量增加，使p53蛋白进入细胞核发挥正常负调节功能的过程受影响，Ueda等^［2］曾在HBx转基因鼠的实验中观察到此现象。Takada等^［11］应用HBx与p53基因共转染的实验也报道了类似结果。

　　在和HBV感染密切相关的HCC与p53基因的关系中，突变并不是主要因素^{［2，8，13］}, 而HBxAg与p53蛋白的相互作用, 导致p53基因的负调节功能失活, 并反式激活, 增强HBV在细胞内的复制, 在HBV相关性HCC发生中更具重要意义。 　　本课题受军队回国人员启动基金资助

　　作者单位：200433　上海第二军医大学病理学教研室

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