小鼠高低转移性肝癌微卫星不稳定性的研究

　　第三军医大学学报2000年第22卷第1期

张树辉　史景泉　魏泓

　　摘　要　目的：了解小鼠高、低转移性肝癌细胞系Hca/16A3-F(F)和Hca/A2-P(P)发生微卫星不稳定性(MSI)情况，探讨它们与肝癌发生及转移之间的关系。方法：随机选择3号和16号染色体上15个多态微卫星标记，采用聚合酶链式反应-简单重复序列多态性(SSLP)和单链构象多态性(SSCP)方法对F和P细胞系进行分析。结果：F和P细胞系有信息的微卫星位点其等位基因与C₃H相同，且存在多位点MSI。结论：该肝癌细胞系3号染色体的MSI在肝癌发生中起重要作用，16号染色体的MSI与肝癌转移密切相关。

　　关键词：肝肿瘤；小鼠；转移；微卫星不稳定性

　　肝癌的发生是由多因素参与并经历多阶段的演变过程，在其发生、发展过程中涉及到一系列遗传学改变，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活等。最近的研究发现，微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)在肿瘤发生、发展中起重要作用^［1，2］。为了探讨MSI与肝癌发生及转移的关系，我们应用微卫星多态性标记对小鼠高、低转移性肝癌细胞系MSI进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本收集

　　小鼠高、低转移性肝癌细胞系Hca/16A3-F(F)和Hca/A2-P(P)由大连医科大学病理学教研室凌茂英教授惠赠^［3］，SPF级C₃H小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，BALB/c小鼠由第三军医大学实验动物中心提供。将F、P细胞用15％胎牛血清RPMI1640培养液配成10⁷/ml，在SPF条件下的超净层流架中以0.2ml/只浓度接种至6周龄BALB/c小鼠右腋中线胸腹联合部皮下，每组12只，10d断颈处死2只，取肿瘤组织供提取DNA用。其余在21d后断颈处死，取肿瘤、肝、肺和淋巴结作病理学检查。

　　1.2　基因组DNA的提取

　　小心去除肿瘤内的坏死和结缔组织，取1cm×0.25cm×0.2cm癌组织块用匀浆器研碎，PBS洗2次，常规蛋白酶K消化，苯酚-氯仿-异戊醇抽提基因组DNA，紫外分光光度法定量后，－20℃冻存备用。另取正常C3H小鼠肝组织作对照。

　　1.3　PCR扩增

　　随机选择3号和16号染色体上15个微卫星位点^［4］，引物序列、预计产物和退火温度见表1，引物均由上海细胞生物研究所合成。

表1　微卫星引物序列

　　tab1　primer sequences for microsatellite loci

　　每个PCR反应体系共25μl，其中10×buffer2.5μl,1.5mmol/LMg^2＋，100pmol/L上游及下游引物、4×dNTP100μmol/L，Taq聚合酶1U,100ng基因组DNA。反应条件：94°C预变性3min，94°C变性1min，退火1min，72℃延伸1～2min，循环30～35次，最后一个循环后置72℃继续延伸7～10min。扩增产物10μl行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测简单重复序列多态性(PCR-SSLP)、5μl行94℃变性5min后行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链构象多态性(PCR-SSCP)，银染后观察结果。将肿瘤组织标本与正常肝组织比较，根据Arzimanoglou等^［2］的判断标准，等位基因带增多、移位和丢失记为MSI。2　结果

　　2.1　高、低转移性肝癌移植瘤的病理学特征

　　移植瘤大多呈圆形，直径2～3cm，灰白色，切面部分区域可见坏死，肿瘤很少有完整包膜。瘤细胞呈巢状、片状排列，其间可见纤维、血管间质；瘤细胞呈多边形或圆形，排列尚紧密，可见瘤巨细胞，核大小不一，形状不规则，可见病理性核分裂像，瘤细胞常侵入周围肌肉组织。接种21d后，P组仅2例发生右腋下淋巴结转移，瘤细胞局限于边缘窦。F组8例发生淋巴结转移，包括双侧腋下和腹股沟皮下，瘤细胞散布于整个淋巴结，部分淋巴结几乎完全被瘤细胞占据；3例可见肺内广泛癌转移灶；肝组织可见嗜酸性或嗜碱性变，枯否氏细胞增生，部分区域可见中性粒细胞浸润。

　　2.2　高、低转移性肝癌微卫星改变

　　在P、F细胞，有信息的微卫星位点其PCR扩增产物等位基因大小均与C₃H小鼠相同。F、P细胞微卫星改变见表2。在3号染色体D3Mit18位点，P和F细胞均发生等位基因丢失，见图1；D3Mit21、D3Nds2出现额外等位基因条带，见图2；在D₃Mit17位点，P细胞等位基因丢失，F细胞出现额外条带，见图3；在16号染色体D16Mit2、D16Mit3和D16Mit5仅F细胞发生等位基因丢失；D16Mit4位点P细胞发生带移位、条带增加，F细胞发生等位基因丢失，见图4。

表2　高、低转移性肝癌微卫星改变

　　tab2　Summary of microsatellite alterations in mouse HCC cell lines

图1　D3Mit18位点、PCR-SSLP

　　fig1　MSI at D3Mit18,PCR-SSLP图2　D3Mit21位点、PCR-SSLP

　　fig2　MSI at D3Mit21,PCR-SSLP

图3　D3Mit17位点、PCR-SSLP

　　fig3　MSI at D3Mit17,PCR-SSLP

图4　D3Mit4位点、PCR-SSLP

　　fig4　MSI at D3Mit4,PCR-SSLP

　　m=Markers；N=C₃H；P=P cells；F=F cells

　　3　讨论

　　微卫星(Microsatellite)是由2～6个核苷酸组成，具有高度多态性的简单串联排列而成的DNA重复序列，广泛存在于原核及真核细胞基因组中，位于很多基因的内含子、基因间隔区，甚至启动子中。微卫星不稳定性(MSI)是指由于复制错误引起的简单重复序列的改变。肿瘤遗传学研究表明，细胞恶性转化与细胞遗传物质的不稳定性有关，而遗传物质的不稳定性系错配修复基因(Mismatch repair gene)突变所致。由于错配修复基因的突变及功能异常造成DNA频发的复制错误(Replication errors,RER)并不断积累导致细胞的微卫星DNA序列发生改变。MSI首先在遗传性非多发性息肉性结肠癌中观察到，以后相继在肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等肿瘤中发现MSI^［1，2］。最近Macdonald等^［5］报道了在人肝细胞癌(HCC)存在MSI，且与DNA错配修复基因hMSH₂和/或hMSH₁位点杂合性丢失(LOH)密切相关。Kazachkov等^［6］发现4/10例(40％)HCC也检出MSI，提示在肝癌发生、发展过程中MSI扮演重要角色。Chen等^［7］用PCR-SSCP技术对N-β-N-(4-羟丁酸)亚硝胺诱发NON/Shi小鼠膀胱癌MSI研究发现，未发生转移的肿瘤组织2/18例存在MSI，而10例发生转移的瘤组织及其转移灶肿瘤组织均未检出MSI。本研究发现由小鼠H₂₂腹水瘤经筛选获得的两个低分化肝细胞癌高低转移性亚克隆细胞系均存在多位点的MSI。

　　已证实小鼠3号染色体与人1、3、4和8号染色体的某些区域具有同源性，在人HCC的4q26～27(IL-2基因位座，此区亦是HBV整合部位)、4q25(EGF基因位座)存在等位基因丢失^［8，9］，1p35～36亦存在LOH^［10］。本研究发现，小鼠高低转移性肝癌3号染色体D3Mit17、D3Mit18位点均存在等位基因丢失，D3Mit21(IL-2基因位座)、D3Nds2(EGF基因位座)位点出现额外条带。提示在小鼠3号染色体上存在肿瘤抑制基因，其失活或突变与肝癌的发生密切相关。在D3Mit17位点，P细胞等位基因丢失，F细胞出现额外条带，提示同一肿瘤的不同亚克隆具有异质性。

　　小鼠16号染色体与人的2、3、16、21和22号染色体的某些区域亦具有同源性。Takahashi等^［11］发现在人HCC22q频繁发生LOH。小鼠纤维肉瘤505细胞系16号染色体多位点的LOH与转移能力密切相关^［12］。本研究结果显示，与P细胞相比，F细胞的D16Mit2、D16Mit3和D16Mit5存在等位基因丢失。表明在16号染色体上，高转移的F细胞系微卫星位点等位基因丢失明显高于低转移的P细胞系，提示在小鼠16号染色体上存在一个与肿瘤转移密切相关的基因，其失活或突变使肝癌细胞发生转移。本研究还发现P细胞系D16Mit4位点发生带移位、条带增加，而F细胞系发生等位基因丢失，可能是由于肿瘤发展过程中，MSI的不断积累导致该等位基因丢失。一般认为MSI是肿瘤发生早期阶段的遗传物质的改变，但在一些具转移能力的肿瘤中也广泛存在MSI，因此对MSI与肿瘤发生、发展的关系仍须进一步加以研究。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600079)；全军“九五”医药卫生科研基金资助项目(96M083)；重庆市攻关项目作者简介：张树辉(1964.5)，男，江苏省淮安市人，博士研究生，主治医师，主要从事肿瘤分子病理学方面的研究，发表论文15篇。电话：198-21099423张树辉(第三军医大学：基础医学部病理学教研室)

　　史景泉(第三军医大学：基础医学部病理学教研室)

　　魏泓(实验动物中心　重庆　400038)

　　参考文献

　　［1］Jackson A L,Leob L A.The mutation rate and cancer［J］.Genetics,1998,148(4):1483－1491.

　　［2］Arzimanoglous Ⅱ ,Gilbert F,Barber H R K.Microsatellite insta-bility in human solid tumors［J］.Cancer,1998,83(9):1808－1820.

　　［3］凌茂英，王明辉，郭伶伶.Hca/16A3-F及 HCa/A2-P两株小鼠淋巴道转移细胞的特性研究［J］.中华医学杂志，1995，75(3)：170.

　　［4］Dietrich W,Katz H,Lincoln S E,et al.A genetic map of the mouse suitable for typing intraspecific crosses［J］.Genetics,1992,131(2):423－447.

　　［5］Macdonald G A,Greenson J K,Saito G,et al.Microsatellite instability and loss of heterozygosity at DNA mismatch repair gene loci occurs during hepatic carcinogenesis［J］.Hepatology,1998,28(1):90－97.

　　［6］Kazachkov Y,Yoffe B,Khaoustov V I,et al.Microsatellite in-stability in human hepatocellular carcinoma:relationship to P53 abnormalities［J］.Liver,1998,18(3):156－161.

　　［7］Chen T,Yamamoto S,Gen H,et al.Infrequent involvement of microsatellite instability in urinary bladder carcinomas of the NON/shi mouse treated with n-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ni-trosamine［J］.Cancer Lett,1998,123(1):41－45.

　　［8］Copeland N G,Jenkins N A,Gilbert D J,et al.A genetic linkage map of the mouse:current applications and future prospects［J］.Science,1993,262(5130):57－66.

　　［9］Chou Y H,Chung K C,Jeng L B,et al.Frequent allelic loss on chromosome 4q and 16q associated with human hepatocellular carcinoma in Taiwan［J］.Cancer lett,1998,123(1):184－192.

　　［10］Yeh S H,Chen P J,Lai M Y,et al.Frequent genetic alte-rations at the distal region of chromosome 1p in human hepato-cellular carcinomas［J］.Cancer res,1994,54(15):4188－4192.

　　［11］Takahashi K,Kudo J,Ishibashi H,et al.Frequent loss of heterozygosity on chromosome 22 in hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology,1993,17(5):794－799.

　　［12］Mafune Y,Asakura H,Kominami R.Allelic losses and metastatic ability of mouse tumor cell clones derived from a heterozygous mouse［J］.Oncogene,1994,9(8):2191－2196.