抗白介素2受体α链单抗及AK细胞治疗肝癌的实验研究

　　中华肝胆外科杂志2000年第6卷第3期

孙倍成　刘根寿　王学浩　邢春根　刘庆宏

　　摘　要　目的　探讨一种新的过继免疫治疗肝癌方法。方法　将肝癌细胞株(H22)接种于近交系BALB/c小鼠皮下，制成荷瘤小鼠模型，用IL-2/AK细胞/抗白介素2受体α链单抗(aIL-2Rα MAb)治疗，以发现其抗肿瘤作用。结果　荷瘤小鼠脾淋巴细胞NK活性无明显变化，LAK和CTL活性及淋巴细胞刺激指数在联合治疗组均高于其他各组(P＜0.01)；肝癌皮下结节在联合治疗组明显受到抑制，肿瘤小鼠生存期明显延长。结论　IL-2，aIL-2Rα MAb及AK细胞联合治疗有非常显著的抗肿瘤作用。

　　关键词：肝肿瘤　白细胞介素2　受体　活化杀伤细胞　单克隆抗体

　　研究表明，肝癌病人sIL-2R浓度增高，细胞毒T细胞(CTL)活性下降，这为肝癌的过继免疫治疗带来了严重障碍。早期过继免疫治疗采用IL-2，但因其作用部位局限，半衰期短，副作用大，限制了其使用。1985年Rosenberg等^〔1〕提出用IL-2/LAK治疗肿瘤，提高了疗效，但对肝癌的治疗效果较差。作者旨在探讨一种新的联合免疫治疗肿瘤的途径，研究经丝裂霉素C灭活的小鼠肝癌细胞H22与IL-2及小鼠脾淋巴细胞共同刺激培养后激活的杀伤细胞(AK细胞)、抗IL-2Rα链单抗及IL-2联合应用对肝癌的治疗作用。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.主要试剂：丝裂霉素C购自Kayowa Hakko Kogyo公司；aIL-2Rα mAb购自北京邦定医学公司；rIL-2购自上海生物化学研究所；［³H］TdR购自上海原子能研究所。

　　2.动物及细胞株：BALB/c近交系小鼠，雄性，8～10周龄，18～20 g，购自中科院上海实验动物中心；小鼠肝癌细胞株(H22)由中科院药物研究所提供。

　　二、方法

　　1.肿瘤模型的建立及分组：取体内传代的H22细胞d 5～d 7的BALB/c小鼠，抽取癌性腹水，用Hanks液洗两遍，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，给每只BALB/c小鼠左股部皮下接种0.1 ml，当皮下长出肿瘤结节达2 mm时，将荷瘤小鼠随机分成4组，每组10只，分别给予不同治疗并观察疗效。A组：Hanks液组。腹腔内注射Hanks液，0.2 ml，每日3次，共3 d。B组：IL-2+AK细胞组。IL-2，腹腔注射，2!000 u每日3次，共3 d，d 1腹腔注射AK细胞(5×10⁸/ml)0.2 ml。C组：IL-2+aIL-2Rα MAb组。IL-2腹腔注射2!000U/次，每日3次，aIL-2R α MAb，200 μg/kg，尾静脉注射0.1 ml每日一次，共3 d。D组：在C组基础上d 1腹腔注射AK细胞，0.2 ml(5×10⁸/ml)。上述治疗每周一次，连续两周，于荷瘤后d15随机杀死各组一半小鼠，并检测体内免疫功能的变化。余一半小鼠留作观察肿瘤大小及生存期。观察肿瘤大小时每周用角规测定生长肿瘤平均直径(mm)一次，以a+b/2代表平均直径，a,b分别代表肿瘤的长和宽。

　　2.小鼠淋巴细胞的制备：无菌取出小鼠脾脏于平皿中，用10 ml圆底试管研磨，经40目不锈钢网及100目尼龙网过滤，用RPMI-1640配成2×10⁶/ml脾淋巴细胞悬液待用。

　　3.AK细胞制备参照文献〔2〕。

　　4.小鼠脾淋巴细胞转化试验检测：参照文献〔3〕，采用［³H］TdR掺入法。用刺激指数(SI)表示，计算公式如下：SI=试验瓶CPM/对照CPM。

　　5.NK，LAK及CTL活性检测：检测NK活性采用［³H］TdR4 h释放法^〔4〕，靶细胞为K562细胞。检测LAK及CTL活性用［³H］TdR18 h释放法，靶细胞分别为P815细胞及H22细胞^〔5〕。结果表示按下式计算：NK(LAK或CTL活性)(%)=(1-实验组CPM均值/自然释放对照组CPM均值)×100。

　　6.统计学分析：采用两样本均数比较的t检验，方差齐性检验及方差分析。

　　结　　果

　　1.实验性荷瘤小鼠经不同治疗后淋巴细胞转化试验情况见表1。

表1　实验性荷瘤小鼠经不同治疗后淋巴细胞转化反应(X±s)

　　D与A，B，C组比较△P＜0.01，A与B，C组比较*P＜0.05　　2.实验性荷瘤小鼠治疗后脾淋巴细胞NK，LAK及CTL活性见表2。从表中可以看出各组NK活性差异无显著意义。D组LAK活性较其他各组均有明显增高(P＜0.01)。B，C组CTL活性与A组相比差异有显著意义(P＜0.05)，D组CTL活性升高更加明显(P＜0.01)。

表2　实验性荷瘤小鼠经治疗后脾淋巴细胞NK，LAK及CTL活性(%，X±s)

　　D与A，B，C比较，△P＜0.01；A与B，C比较，* P＜0.05　　3.实验性荷瘤小鼠经不同治疗后肿瘤结节生长情况。从皮下结节直径为2 mm时开始进行治疗，结果发现D组肿瘤结节起初生长缓慢，但在3周后肿瘤结节增长逐渐加速。A组肿瘤结节生长迅速，局部出现坏死和溃疡，小鼠均于3～4周死亡。B，C组肿瘤结节的生长均有一定程度的抑制，见图1。

图1　实验性荷瘤小鼠经Hanks液，IL-2+AK，IL-2+

　　aIL-2R α MAb及IL-2+AK+aIL-2R α MAb治疗后皮下肿瘤结节生长抑制情况

　　4.实验性荷瘤小鼠经不同治疗后存活期。经治疗后存活期分别为：A组(23.0±2.57) d；B组(33.4±2.84) d；C组(31.3±3.25) d；D组(52.1±6.67) d。经统计学处理后发现：B，C组与A组比较差异显著(P＜0.01)；D组与其他各组相比差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。

　　讨　　论

　　1.aIL-2R α MAb治疗肿瘤机理。IL-2R由两条多肽链组成，即α链和β链。根据与IL-2结合的亲和力不同，IL-2R可分为低亲和力受体(P55分子，Tac抗原，IL-2Rα)，中亲和力受体(P75分子，IL-2Rβ)和高亲和力受体^〔6〕。高亲和力受体是由P55和P75分子结合形成。只有IL-2与高亲和力受体相互作用后才能引起细胞增殖效应。IL-2与低亲和力受体结合后不能产生细胞的内在化过程。Rosenberg等^〔7〕认为IL-2对T细胞活化有双向调节作用。即IL-2与高亲和力IL-2受体结合后使T细胞活化，释放多种细胞因子，如IL-2，IFN-γ，IL-4等，同时活化Tac基因，表达更多P55分子，与IL-2结合后不能使T细胞活化，从而趋向静止。故aIL-2Rα MAb抗肿瘤的机理可能是参与IL-2对T细胞活化的双向调节作用，消耗过多的P55分子，使T细胞趋向活化。

　　2.AK细胞+IL-2治疗肿瘤的机理。肿瘤局部不能产生IL-2R，故不能排斥肿瘤，AK细胞作为一种非特异性刺激物，进入腹腔后作为一种抗原，刺激T细胞表达IL-2R，使之与IL-2作用^〔8〕，腹腔内注射IL-2后可诱导功能特异的细胞毒T细胞增殖，并迁移到肿瘤生长部位，发挥杀伤肿瘤效应。

　　肿瘤机体CTL前体细胞不能成熟，在腹腔注射灭活的肿瘤细胞后，可使这种前体细胞大量在腹腔内聚集，当腹腔注射IL-2后使CTL前体细胞成熟，变成效应CTL细胞，从而迁移到肿瘤部位杀伤肿瘤^〔9〕。该研究结果中提示CTL活性在治疗组明显增强，也支持这点。

　　本研究用IL-2R，AK细胞及aIL-2R α MAb联合治疗，可能是产生了协同杀伤肿瘤作用，一方面产生大量CTL细胞，一方面使Tc细胞持续活化，产生细胞因子，从而杀伤肿瘤。

　　作者单位：孙倍成（210029　南京医科大学第一附属医院肝胆外科)

　　王学浩（210029　南京医科大学第一附属医院肝胆外科)

　　刘根寿（苏州医学院附属第二医院普外科)

　　邢春根（苏州医学院附属第二医院普外科)

　　刘庆宏（苏州医学院附属第二医院普外科）

　　参考文献

　　1，Rosenberg sA, Lotze MT, Muul LM, et al. Observation on the systematic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med, 1985, 313: 1485-1492.

　　2，王建莉，曹雪涛，孔宪涛，等.成纤维细胞介导的人α型干扰素基因疗法与过继免疫化疗联合治疗人肝癌的实验研究.中华肿瘤杂志，1996，17：266-269.

　　3，李其英，徐勉忠，孔祥云，主编.实用临床医学检验.武汉:湖北人民出版社，1982.628.

　　4，黄晋生，刘为纹，袁爱力，等.用³H-TdR 4小时释放法检测自然杀伤细胞活性.第三军医大学学报，1992，14：283-284.

　　5，曹雪涛，主编.白细胞介素-2的基础与临床.北京：北京科学技术出版社，1990.184-185.

　　6，Waldmann TA. The multi-subunit interleukin-2 receptor. Ann Rev Biochem,1989, 58:875-910.

　　7，Rosenberg SA, Lotze MT, Mule JJ, et al. New approach to the immunotherapy of cancer using interleukin-2. Ann Intern Med, 1988, 108:853-864.

　　8，Tanida S, Uchida H, Taniguchi K, et al. Marked reduction of subcutaneous tumor growth by intraperitoneal administration of recombinant human interleukin-2 with a cell accumulator, proteose peptone, in mice. Cancer Res,1989, 49:284-288.

　　9，Harada M, Matsuzaki G, Shinomiya Y, et al. Generation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by combined treatment with inactivated tumor cell and recombinant interleukin-2. Cancer Immunol Immunother, 1994, 38:332-338.