携带HSV-TK基因的人肝癌特异性EB病毒表达载体的构建及临床意义

中华实验外科杂志 1999年第2期第16卷 论　著

作者：胡俊波　吴在德　颜子颖　侯云德

单位：430030　武汉，同济医科大学附属同济医院外科(胡俊波、吴在德)；预防医学科学院病毒所病毒和基因工程国家重点实验室(颜子颖、候云德)

　　关键词： 肝癌；EB病毒表达载体；HSV-TK基因；α-FP启动子

　　【摘要】　目的　构建人肝癌组织特异性的基因治疗载体并探讨其临床意义。方法　利用重组DNA技术将HSV-TK基因插入到含有及不含有α-FP启动子的EB病毒表达载体pEBAF5.1、pDR2中，并通过限制性内切酶分析鉴定重组质粒。结果　TK基因成功地克隆入pEBAF5.1及pDR2中。结论　含有α-FP启动子的EB病毒表达载体是原发性肝癌基因治疗中新型、理想的候选载体之一。

　　 Construction of human hepatocellular carcinoma tissue-specific EBV-based vector harboring HSV-TK and its clinical implication　HU Junbo^*, WU Zaide, YAN Ziying, et al.^* Department of Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

　　 　　【Abstract】　Objective　To construct human hepatocellular carcinoma tissue-specific gene therapy vectors, and study its clinical implication. Method　HSV-TK gene was inserted into EBV-based vector pDR2 and pEBAF5.1 containing α-FP promoter and enhancer by using recombinant DNA technique. The recombinant plasmids were analyzed and identified by restriction enzyme.Result　1.79 kb TK gene fragments were separately successfully cloned into pDR2 and pEBAF5.1 by restriction enzyme analysis. Conclusion　EBV-based vector harboring α-FP promoter and enhancer is a novel ideal candidate vector for hepatocellular carcinoma gene therapy.

　　 　　【Key words】　Hepatocellular carcinoma　EBV-based vector　HSV-TK gene　α-FP promoter

　　我们选择了新型高效EB病毒表达载体和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因，构建了含人肝癌组织特异性甲胎蛋白(α-FP)的启动子，以及HSV-TK基因的人肝癌特异性EB病毒表达载体pEBAF/TK，并探讨其在肝癌基因治疗中应用的可行性及潜在的应用价值。

　　 材料及方法

　　1. 载体、目的基因及转录调控序列　EB病毒表达载体pDR2购自美国Clontech公司；含有人甲胎蛋白(α-FP)基因上游启动子及增强子5.1kb片段的EB病毒表达质粒pEBAF5.1由病毒所基因室颜子颖博士构建并赠送，含有HSV-TK基因的质粒pHSV-106购自北京东方试剂公司。

　　2. 菌株　大肠杆菌DH52由病毒所基因室提供。

　　3. 工具酶　实验用各种限制性内切酶，T4DNA连结酶分别购自美国New England Biolabs公司及德国Boehringer Mannheim公司。溶菌酶和核糖核酸酶(RNase)购自北京华美生物工程公司及美国Sigma公司。

　　4. 载体的构建　包括质粒小量及大量制备，内切酶分析，目的DNA片段的回收，感受态细菌的制备，DNA片段的连接及转化等均按分子克隆^［1］并有所改进。

　　5. 细胞株　肝癌细胞系HepG2购自日本筑波细胞库(RCB)，培养液为含10%胎牛血清的DMEM。

　　结　果

　　1. 重组质粒pDR2/TK、pEBAF/TK的构建　将pDR2经BamHI和PVUⅡ双酶切回收10.57kb的大片段，将pHSV-106用PVUⅡ，BglⅡ双酶切，回收1.79kb的小片段，然后以一定比例混合，加入T4DNA连接酶，16℃保温8小时，转化大肠杆菌DH52，快提质粒做内切酶分析，筛选出已插入TK基因片段的重组质粒pDR2/TK。同样地，我们用BamHI和PVUⅡ双酶切消化pEBAF5.1，在低熔点琼脂中回收15.375kb的大片段，用BglⅡ，PVUⅡ双酶切消化pHSV-106，回收1.79kb的小片段，用与上述相同的方法，筛选出含有TK基因及α-FP启动子基因的重组质粒pEBAF/TK。

　　2. 重组质粒pDR2/TK及pEBAF/TK的酶切鉴定　分别用SacI,EcoRV,PstI三种不同的酶酶切对照质粒pDR2和重组质粒pDR2/TK，产生的酶切片段大小如图1所示，说明TK基因已正确地插入到载体pDR2中。同样地我们用EcoRV，MluI，PstI分别酶切重组质粒pEBAF/TK及对照质粒pEBAF5.1产生不同的酶切片段，结果见图2，表明TK基因已正确插入载体pEBAF5.1中。

图1　真核表达质粒pDR2/TK的内切酶谱

　　注： 1.pDR2/TK PstI　2.pDR2 PstI　3.PBR322 DNA/BstN I Marker　4.λDNA HindⅢ Marker　5.pDR2/TK SacI　6.pDR2 SacI　7.pDR2/TK EcoRV　8.pDR2 EcoRV

图2　真核表达质粒pEBAF/TK的内切酶谱

　　注： 1.pEBAF/TK PstI　2.pEBAF5.1 PstI　3.PBR322 DNA/BstN I Marker　4.λDNA HindⅢ Marker　5.pEBAF/TK EcoRV　6.pEBAF5.1 EcoRV　7.pEBAF/TK MluI　8.pEBAF5.1 MluI

　　讨　论

　　我们尝试运用HSV-TK/GCV体系来针对复发性肝癌及晚期肝癌进行基因治疗。HSV-TK基因如何导入肿瘤细胞并在其中表达是此种基因疗法的关键。我们选择了质粒型真核表达载体EB病毒表达载体^［2］，构建含有HSV-TK基因的重组质粒来用于原发性肝癌的药敏自杀性基因治疗。pDR2，pEBAF5.1是带有EB复制子orip及对复制必需的反式作用因子EBNA-I的EB病毒表达载体，此类载体在染色体外能自主复制，且不发生缺失、整合和重排，可稳定地存在于细胞染色质外。它可通过一些非病毒介导的方法来实现目的基因的表达，且可反复使用以提高转染效率。严格地来说该载体仅是一种携带了EB病毒质粒型复制所必需的序列原件的哺乳动物细胞质粒，与传统意义上的病毒载体有许多不同，它没有病毒感染的潜在危险，具有其他病毒载体无可比拟的优势。

　　理想的基因转移系统不仅要求转染效率高，而且要求具有特异性，并使转移的基因处于有效的调节之下^［3，4］。本实验利用EB病毒表达载体的特性，并用人α-FP启动子及增强子全序列(5.1kb)来特异性调控HSV-TK基因的表达，成功地构建了携带有HSV-TK基因的人肝癌特异性及非特异性EB病毒表达载体pEBAF/TK，pDR2/TK。在已进行的初步实验结果中，表明转染了pEBAF/TK基因的肝癌细胞HepG2对ACV的敏感性比pDR2/TK高。它且在临床应用中将具有安全（非病毒感染）、高效、特异等特性，且可反复使用。为进一步研究和建立有效的肝癌基因疗法打下了一定基础。

　　本课题为863国家高技术发展计划资助项目

　　 参考文献

　　1　Maniatis T, Fritisch E, Sambrook J. Molecular cloning 2th ed. Cold Spring Harbor. New York, 1989-1991.

　　2　Margolskee RF. Epstein-Barr based expression vector. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1992，158:67-90.

　　3　Glorioso J. Gene therapy 1995: Development on the horizon. Gene Therapy, 1995，2:81-83.

　　4　Herrmann F. Cancer gene therapy: principles, problems, and perspectives. J Mol Med, 1995，73:157-163.

(收稿： 1998-05-10　修回： 1998-09-27)