裸鼠肝癌转移模型组织中细胞间粘附分子1的表达

中华实验外科杂志 1999年第2期第16卷 论　著

作者：孙婧　周信达　刘银坤　周铬　陈军　汤钊猷

单位：200032　上海医科大学中山医院肝癌研究所［孙婧(现在上海第二军医大学东方肝胆外科医院工作，邮政编码： 200433)周信达、刘银坤、周铭、陈军、汤钊猷］

　　关键词： 肝癌；肿瘤转移；细胞间粘附分子1

　　【摘要】　目的　研究细胞间粘附分子1(ICAM-1)在肝癌转移过程中的作用和作为预测肝癌转移标志物的价值。方法　以裸鼠人肝癌转移模型为材料，以dotimmuno-blot的方法测定不同生长时间肝癌组织中ICAM-1的表达。结果　ICAM-1在肝癌组织中的表达与肿瘤的生长时间呈明显的正相关(r=0.88,P＜0.01)，与肿瘤大小呈正相关(r=0.05,P＜0.05)，在肝癌转移发生后ICAM-1表达突然升高，以后维持在较高水平，肿瘤转移组高于无转移组(P＜0.01)，多脏器转移组高于单脏器转移组(P＜0.05)。结论　组织中ICAM-1的表达可以反映裸鼠人肝癌的生长转移状态，可以作为预测其转移的标志物。

　　Phasic expression of tissue intercellular adhesion molecule-1 in human liver cancer metastasis model in nude mice　SUN Jingjing, ZHOU Xinda, LIU Yinkun, et al. Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200032

　　 　　【Abstract】　Objective　To study the role of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in the process of hepatocellular cancer (HCC) metastasis and the probability of ICAM-1 as a marker to predict HCC metastasis.Method　Tissue ICAM-1 expression in liver cancer of different growing stages was detected by using dot immuoblot.Result　Tissue ICAM-1 expression in liver cancer was obviously positively related with tumor growing stage (r=0.88,P＜0.01)，tumor size(r=0.05,P＜0.01). Tissue ICAM-1 expression was increased suddenly when metastasis happened and then kept in high level. Tissue ICAM-1 was higher in metastasis HCC than in mon-metastasis HCC (P＜0.01)，higher in multisite metastasis HCC than in monosite metastasis HCC (P＜0.05). Conclusion　Tissue ICAM-1 expression could reflect the growth and metastasis of HCC, and might be used as a marker for HCC metastasis.

　　 　　【Key words】　Liver cancer　　Tumor metastasis　　Intercellular adhesion molecule-1

　　我们以裸鼠肝癌转移模型LCI-D20(Liver cancer institute-data 20)^［1］为材料，研究细胞间粘附分子1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)在肿瘤生长转移过程中的时相表达变化，探讨ICAM-1做为预测和早期诊断肝癌转移的标志物的可能性，结果报道如下。

　　材料和方法

　　1. 材料　ICAM-1单抗购于英国R&D公司，浓度为1g/L。AKP标记的兔抗鼠IgG购于华美公司。MIAS-300全自动图像分析仪由四川大学生产，硝酸纤维素膜购于Sigma公司。瘤源为上海医科大学中山医院肝癌研究所LCI-D20裸鼠人肝癌高转移模型^［1］。

　　2. 方法　BALB/CA雄性裸小鼠，购于中科院上海药物研究所，鼠龄4～6周，体重17～20g。1%戊巴比妥钠40～50ng/kg体重腹腔注射麻醉，将瘤块植于肝内。于术后7、10、13、16、19、22、32、36天分别以摘眼球放血的办法处死动物，观察、记录肿瘤大小、肝内及全身各器官有无肉眼可见转移灶及其数目。取双肺及残留肉眼正常肝组织石蜡包埋连续切片，观察转移灶及其数目。取种植处的肝癌组织放入液氮冷冻后-70℃保存。

　　将待测肝癌组织以含1%Triton-100的悬浮缓冲液进行组织匀浆，离心取上清，将上清30μl点于硝酸纤维素膜上。以生理盐水为对照，5%脱脂奶粉非特异性封闭，PBS洗膜，ICAM-1单抗1∶500室温孵育2小时，AKP标记的二抗室温孵育2小时，显色剂显色。组织匀浆蛋白定量采用Hartree法^［2］。结果由上海医大图像分析中心采用MIAS-300全自动图像分析仪分析。ICAM-1采用相对定量，以图像分析仪所读灰度代表ICAM-1含量，ICAM-1量=(样品灰度-本底灰度)×样品面积/蛋白含量/1000。数据采用两组样本资料的t检验。

　　结　果

　　1. 原位肝癌生长转移情况　癌组织接种术后第7天开始，每3天处死动物，第7天因肿瘤仅0.2～0.3cm³大小无法取材做蛋白测定，第10、13天也仅各有1只裸鼠肿瘤生长足够取材做蛋白测定。第7、10、13、16天体内除肝内接种病灶，未见转移灶，第19天开始出现转移灶，处死的3只裸鼠有2只有转移，一只在髂窝部肉眼见直径0.2cm的转移灶，一只光镜下见肺内转移灶。第22、32、36天，随着肿瘤接种时间延长，肿瘤逐渐生长，转移灶数目及转移灶出现部位逐渐增多，在髂窝、沿输尿管、两肾下极、盆腔、肠系膜、主动脉旁、肝内均可见转移灶，严重时可有血性腹水出现。

　　2. 肝癌组织中ICAM-1含量(±S)与肝癌生长时间的关系　肝癌生长10天(1例)，ICAM-1含量为2.71±0；13天(1例)，2.78±0；16天(3例)，2.53±0.53；19天(3例)，5.30±0.81；22天(3例)，7.77±1.21；32天(5例)，8.69±2.01；36天(2例)，6.57±1.95。组织ICAM-1在肿瘤生长过程中逐渐升高，肿瘤种植后10、13、16天变化不大，第19天突然升高近二倍(P＜0.01)，正是在第19天出现远处转移灶。因此，认为组织ICAM-1可较敏感地反映早期肿瘤转移的发生。36天时动物出现血性腹水，衰竭，肿瘤内有大量不规则坏死，致使组织内ICAM-1下降。

　　3. 肝癌组织中ICAM-1表达与肝癌大小的关系见图1。

图1　肝癌组织中ICAM-1表达与肝癌大小的关系

　　4. 不同转移状态肝癌组织ICAM-1的表达肝癌组织ICAM-1含量有转移组(10例)为8.24±0.90，无转移组(7例)为3.03±0.51，有转移组约是无转移组的2.5倍(P＜0.01)。多处转移组(5例)为10.05±1.17明显高于单处转移组(5例)的5.48±0.49(P＜0.05)。可见组织ICAM-1的表达随肝癌转移状态的发展而增高，可以反映肝癌的转移程度。

　　 讨　论

　　我们以往的研究发现，人肝癌组织和血清中的ICAM-1含量呈有转移肝癌病人＞无转移肝癌病人＞正常人，证明ICAM-1与肝癌的转移复发有关^［3-4］。我们在此基础上以LCI-D20裸鼠人肝癌高转移模型肿瘤原位接种，在肿瘤生长的不同阶段取肝癌组织，检测组织中ICAM-1的表达。发现肝癌接种后随着时间的进展肿瘤生长，转移发生发展，组织中ICAM-1的表达逐步增高，与肝癌生长的时间成正比、与肝癌大小成正比，在转移发生后有一个突然的升高，并与肝癌的转移程度成正比。本结果表明，组织中ICAM-1的表达随肝癌的恶性程度增加和转移能力增加同步增长，是一个可以早期反映实验性肝癌转移发生的标志物。

　　本课题为美国CMB基金(93-583)、国家自然科学基金(96707)和国家“九五”攻关课题基金资助项目(96-906-01-15)

　　 参考文献

　　1　Sun FX, Tang ZY, Liu YK, et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues. Int J Cancer, 1996,66:239-243.

　　2　Hartree EF. Determination of protein: a modification of Lowry method that gives a linear photometric response. Anal Biochem, 1972,48:422-427.

　　3　孙婧，周信达，周铬，等. 血清中细胞间粘附分子1与肝癌侵袭转移关系的初步观察. 中华医学杂志，1998,5：383.

　　4　孙婧，周信达，刘银坤，等. 肝癌组织中细胞间粘附分子1与肝癌侵袭转移关系的研究. 中国癌症杂志，1997,7：161-163.

(收稿： 1997-09-15　修回： 1998-08-20)