肝癌患者血清及癌组织中β-葡萄糖醛酸酶同步测定及意义

中华实验外科杂志 1999年第1期第16卷 论　著

作者：杨波　张弘　王浩　朱善德　杜晓炬　蒲菲菲　康健

单位：110015　沈阳军区总医院(杨波，朱善德，杜晓炬，蒲菲菲，康健)；中国医科大学病理教研室(张弘)；解放军第406医院普外科(王浩)。

　　关键词： 肝癌；β-葡萄糖醛酸酶；ELISA；免疫组化；免疫电镜

　　 　　【摘要】　目的　探讨原发性肝细胞癌患者体内β-葡萄糖醛酸酶(β-G)变化规律。方法　采用ELISA法、免疫组化法对31例原发性肝细胞癌患者血清及癌组织中β-G进行同步研究，并对其中10例进行免疫电镜研究。结果　β-G在肝癌患者血清及癌组织中都呈过度表达，与对照组有非常显著性差异(P＜0.01)。结论　对β-G机能学及形态学的联合检测，可能成为肝癌诊断的辅助指标。

　　 The synchronous detection of β-glucuronidase both in serum and carcinoma tissue in hepatocarinoma patients and its clinical implication　Yang Bo^*, Zhang Hong, Wang Hao, et al. ^*?Department of Surgery, General Hospital of Shenyang Military Area. Shenyang 110015

　　【Abstract】　Objective　To study the change of β-glucuronidase (β-G) in the patients with primary hepatic carcinoma. Method　β-G was detected synchronously both in the serum and carcinoma tissue of 31 cases of primary hepatic carcinoma by using the methods of ELISA and immunohistochemistry separately. Among them, 10 cases were studied by the immunoelectromicroscopic technique. Result　β-G was highly expressed both in the serum and carcinoma tissue in hepatic carcinoma patients and there was very significant difference as compared with the control group (P＜0.01). Conclusion　The combined functional and morphological examination of β-G might be useful to the early discovery and early diagnose of hepatic carcinoma.

　　【Key words】　Hepatic carcinoma　β-glucuronidase ELISA Immunohistochemistry Immunoelectromicroscopy

　　为探讨原发性肝细胞癌β-葡萄糖醛酸酶(β-G)的整体变化规律，我们采用ELISA法、免疫组化法对31例患者血清及癌组织进行同步实验研究，并对其中10例进行免疫电镜研究，以期为肝癌的临床诊断提供有意义的指标。

　　材料和方法

　　1. 标本来源　选取沈阳市1996年至1997年原发性肝细胞肝癌患者31例， 其中男25例， 女6例，平均年龄43.7岁；病理报告： 中低分化肝细胞肝癌18例，高分化13例。13例肝外伤手术切除肝细胞，男12例，女1例，平均28.3岁。正常对照组35例，男21例，女14例，平均35.7岁。106名健康献血员，男67名，女39名，平均32.5岁。

　　抗β-G抗体为美国阿拉巴马大学K.J.Ho教授惠赠。ELISA试剂为北京四环公司产品；免疫组化及免疫电镜试剂均为Sigma公司产品。

　　2. 血清β-G测定　血清标本均为空腹静脉血，其中肝癌患者为术前空腹静脉血。ELISA法建立的最优条件为： 多克隆抗β-G抗体工作浓度为1∶2000，单克隆抗β-G抗体工作浓度为1∶1000。以邻苯二胺为底物，2mol/L H₂SO₄终止反应，于酶标仪490nm处测吸光度值，参比波长655nm。按常法计算判断值，为(样本吸光度/阴性对照吸光度≥2为阳性)。阳性样本以倍比方式稀释至阴性时的滴度为测得值。

　　参考值的确定：测取106名健康献血员血清β-G滴度，用几何均数法计算均数及标准差，再按95%单侧可信限求得正常上限为6.7，单位为滴度，拟定大于7为阳性。

　　3. 组织β-G测定　(1) 免疫组化法测定： 分别对31例肝癌组织及13例外伤肝组织常规制作石蜡切片，厚度4μm。抗β-G单克隆抗体工作浓度1∶200，采用ABC法，每例均用PBS代替Ⅰ抗作空白对照，光镜观察。着色标准： 细胞浆内出现棕黄色颗粒为β-G阳性反应细胞，每例标本记数200个细胞，以每100个计数的肿瘤细胞中呈现阳性反应细胞数表示。根据β-G阳性反应细胞数量分为三级，阳性细胞百分率≤25%为(-)，25%～50%为(+)，50%～75%为(++)，＞75%为(+++)。(2) 免疫电镜法测定： 选取31例中10例肝癌癌灶组织行免疫电镜标本制作，方法参照文献［1］。结果判断： 电镜下取同样放大倍数为27000倍，对每张切片至少选取10个任意分布区，对其中溶酶体摄像，再经IPS-500型图像分析仪处理，测取1μm²溶酶体内金标颗粒数目，方法参照文献［1，2］。

　　4. 统计学处理　血清学检测采用t检验。免疫组化结果以百分率表示，率的显著性检验采用χ²检验，不同等级分组资料之间比较采用等级秩和检验。

　　结　果

　　肝癌患者血清β-G水平(16.59±1.69)与正常对照组(6.45±1.20)比较有非常显著性差异(P＜0.01)。免疫组化组织学比较，肝癌患者β-G表达水平(71.4%±3.4%)较对照组(28.3%±4.2%)有非常显著性差异(P＜0.01)。表1表示肝癌分化愈差，β-G表达愈多(P＜0.01)呈一致性关系。

表1　肝癌分化程度与β-G表达强度的关系

　　免疫电镜结果表明，超微状态下肝癌细胞内β-G的表达以溶酶体为集中，金颗粒计数为36.4±6.7个/μm²与正常肝细胞(10.2±3.1个/μm²)比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。

讨　论

　　β-G广泛存在于人体的各种组织及体液中，具有参与细胞增生的生理功能，在病理状态下，β-G可以作用于葡萄糖醛酸甙的β-糖苷键，水解癌周结缔组织中的蛋白多糖及糖蛋白，破坏其网状结构的防御作用，有利于癌细胞的浸润及扩散^［3］。为此，人们对其与肿瘤的关系进行探讨，以期寻找新的肿瘤标志物。国内外对β-G与肝脏肿瘤关系的研究，报道不多。

　　本组ELISA法检测肝癌患者血清β-G活性比正常对照组明显增高。免疫组化及免疫电镜法检测癌组织中β-G表达明显高于正常对照肝组织，在细胞及亚细胞超微水平的表达是统一的。且β-G在组织中的表达程度与肝癌细胞的分化程度呈一致性关系。

　　细胞无限制自主增殖是肿瘤产生与发展的基本特征，我们认为： β-G在肝癌患者血清及癌组织中异常增高，是由癌细胞自身的生物学特性决定，缘于肿瘤细胞为适应其快速、过度增殖和异常分化的自主性生长的生存方式而产生的自我调控，由其自身独特的生长方式决定并成为内因的。

　　β-G作为一种体内酶标志，是与肝癌的发生、发展相关的体内活性酶，对其血清及癌组织的联合检测，可能成为肝癌诊断的辅助指标。

　　本课题为辽宁省自然科学基金资助项目(No.962252)

　　 参考文献

　　1　杨波，朱善德，杜晓炬，等. 人肝细胞超微结构β-葡萄糖醛酸酶分布的定位定量研究及意义. 中华实验外科杂志，1996，13：342-343.

　　2　Weidner, Semole, JP, Welch, WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation invasive breast carcinoma. N Engl Med, 1991,324:1-3.

　　3　苗德林，黄幼蓉，程本宽，等. 胃癌细胞的β-葡萄糖醛酸酶及β-N-乙酰葡萄糖胺酶与浸润的关系. 中华病理杂志，1987，16：269-270.

(收稿： 1998-05-18　修回： 1998-10-12)