巢式RT-PCR检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中AFPmRNA

中华实验外科杂志 1999年第1期第16卷 新技术与新方法

作者：刘扬　张柏和　钱光相　陈汉　吴孟超

单位：200433　上海，第二军医大学东方肝胆外科医院

　　关键词： 肝细胞癌；RT-PCR；裸鼠；AFPmRNA

　　【摘要】　目的　应用巢式RT-PCR检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中AFPmRNA，并探讨其意义。 方法　抽取20只荷人肝癌裸鼠周围静脉血液各1ml，应用巢式RT-PCR检测其周围静脉血液中AFPmRNA。 结果　20只荷瘤裸鼠中有6只血液中被检测到AFPmRNA(30.0%)，其中有4只发现了肺脏、肝脏或肾脏转移(66.67%)。 结论　AFPmRNA可以作为肝癌血液转移的敏感性指标，也可作为肝癌远处转移的预测性指标之一。

　　 Detection of blood AFPmRNA in the mice bearing with human carcinoma using nested reverse transcriptase polymerase reaction　Liu Yang, Zhang Baihe, Qian Guangxiang, et al. The East Institute of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University, Shanghai 200433

　　 　　【Abstract】　Objective　To detect the blood AFPmRNA in the nude mice bearing with hepatocellular carcinoma (HCC) using nested reverse transcriptase polymerase reaction (nested RT-PCR) and its implication. Method　One ml of blood each in 20 samples from the nude mice bearing with human HCC was taken and the AFPmRNA was detected by using nested RT-PCR.Result　AFPmRNA was detectable in 6 blood samples from mice bearing with human HCC (30.0%), in which 4 mice were found having metastasis (lung, liver, or kidney).Conclusion　AFPmRNA may be used as an efficient and sensitive indicator for blood spread of HCC cells and for the occurrence of metastasis of HCC.

　　 　　【Key words】 Hepatocellular carcinoma Nested reverse transcriptase polymerase reaction Nude mice

　　 　　我们通过应用巢式逆转录多聚酶链反应(巢式RT-PCR)检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中AFPmRNA，探讨其在肝癌血液转移及远处器官转移中的作用及意义，现报道如下。

　　材料和方法

　　1. 动物选择　选择能分泌AFP的人肝癌细胞株SMMC-LINM(由本校病理解剖教研室提供)，接种在4周龄大小的正常裸鼠(BALB/C/NU)颈背部皮下(每只裸鼠一次性接种肿瘤细胞约10⁷个)。待6周后，裸鼠皮下肿瘤长至直径2～4cm时用于实验，体重15～20g。选择20只上述标准裸鼠进行实验。

　　2. 标本收集　手术摘除裸鼠双侧眼球取血(约1ml)置12ml离心管内(经0.1%的DEPC处理后)，加入0.1ml肝素混匀后备用。切除裸鼠皮下肝癌组织，观察肿瘤包膜完整性及其与周围组织的关系(有无浸润转移)。同时切除裸鼠肝、肺、肾及肾上腺等血供丰富器官，置于10%福尔马林液中固定24小时后，石蜡包埋，HE染色，观察肝癌器官转移情况。

　　3. 实验方法　① 有核细胞的制备： 采用密度梯度离心法^［1］。② 抽提细胞总RNA： 采用异硫氰酸胍一步抽提法。③ 合成cDNA： 应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。④ 巢式PCR： PCR循环条件参照Komeda^［2］并略有改进^［3］。⑤ 采用微机技术从Pc基因软包中寻求对PCR终产物仅有一个酶切位点的核酸内切酶PstⅠ，其可将PCR终产物(101bp)酶切成60bp及41bp两个片段。⑥ 统计学处理： 采用卡方检验及四格表概率计算法。

　　结　果

　　1. 20只荷人肝癌裸鼠皮下肿瘤包膜均完整，巨检未见明显局部器官浸润及肝、肺、肾等重要器官转移。其中有6只血液中被检测到AFPmRNA(30.0%)，在这6只裸鼠中有4只镜检发现了肺脏、肝脏或肾脏转移(66.7%，P＜0.01)，其中有1只裸鼠同时发生了肺脏及肾脏转移，其余16只荷瘤裸鼠病理检查未见异常。

　　2. 6例血流AFPmRNA阳性检出者，皮下肿瘤直径均在3cm以上，而肿瘤直径小于3cm者无1例发生远处器官转移(P＜0.01)。

　　3. 在12只血清AFP浓度大于4000μg/L的荷瘤裸鼠中，有6只血液中被检测到AFPmRNA(50.0%)，而在8只血清AFP浓度低于4000μg/L的荷瘤裸鼠中无1例血液AFPmRNA阳性者(P＜0.01)。

　　讨　论

　　近年来，国外学者应用检测到血液中肿瘤细胞特异性mRNA的存在，以间接的方式推测肿瘤细胞发生转移^［1，2］。由于肿癌细胞溶解破坏所释放的AFPmRNA在血液中存在大量RNA酶的状况下，不可能存在或被立即破坏，因此从血液中检测到AFPmRNA，可以判断其来自于血液中播散的肝癌细胞^［3］。本实验表明，在所有20只荷瘤裸鼠周围静脉血液中有6只被检出AFPmRNA(30.0%)，其中有4只发生了远处器官转移(66.7%)，而在14只血液AFPmRNA(-)的荷瘤裸鼠中无1例发生远处器官转移(P＜0.01)，表明荷人肝癌裸鼠发生远处器官转移是经血液播散种植转移而进行的。同时，血液AFPmRNA检出率与肿瘤直径，血清AFP浓度，肿瘤远处器官转移有明显关系(P＜0.01)。说明血液AFPmRNA是肝癌远处器官转移发生的必要条件之一。因此AFPmRNA可以作为判断肝癌血液转移的有效指标，也可作为肝癌远处转移的预测性指标之一。

　　本课题为军队重点实验室资助项目

　　 参考文献

　　1　Kar S, Carr BI. Detection of liver cells in peripheral blood of patients with advanced-stage hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995, 21:403-405.

　　2　Komeda T, Fukuda Y, Sando T, et al. Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood. Caner, 1995, 75:2214-2219.

　　3　刘扬，吴孟超，钱光相，等. 肝癌术后检测血液AFP及AFPmRNA的临床意义.中华普通外科杂志，1998，13：163-165.

(收稿： 1998-02-16)