基质金属蛋白酶抑制剂BB-94对肝癌生长和侵袭转移的影响及其机理研究

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 论著

作者：卜文　汤钊猷　刘康达　叶胜龙　薛琼

单位：200032　上海医科大学中山医院肝癌研究所

　　关键词： 抑制剂；金属蛋白酶；细胞外基质；癌；肝脏；肿瘤侵袭；肿瘤转移

　　【摘要】　目的　了解基质金属蛋白酶抑制剂对肝癌生长和侵袭转移的影响及其机理。方法　通过腹腔注射BB-94对原位移植的转移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20进行治疗，观察BB-94对肝癌生长和侵袭转移等影响，并通过明胶酶谱法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、体外侵袭试验、MTT试验等方法对BB-94对肝癌生长和侵袭转移等的影响的机理进行了研究。结果　BB-94对LCI-D20肿瘤生长、侵袭转移均有明显的抑制作用，并能延长其生存期；LCI-D20组织中可见基质金属蛋白酶1、2、9的表达；BB-94可抑制肝癌细胞株SMMC-7721的体外侵袭，但不能抑制SMMC-7721的增殖。结论　BB-94可抑制肝细胞癌的生长和侵袭转移。

Effects of matrix metalloproteinase inhibitor BB-94 on the growth and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma and their mechanisms

BU Wen, TANG Zhaoyou, LIU Kangda, et al.

　　Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】　Objective　To understand the effects of matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor BB-94 on the growth and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma and the mechanisms.Methods　BB-94 was intraperitoneally injected to treat orthotopic metastatic human hepatocellular carcinoma nude mice model LCI-D20. The effects of BB-94 on the growth and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma were observed. Gelatin zymography, RT-PCR, in vitro invasion assay and MTT assay were employed to study the mechanisms of the effects produced by BB-94.Results　BB-94 could inhibit the growth and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma and prolong the survival time. In LCI-D20 tissue, expression of MMP-1,-2，-9 was found. BB-94 could inhibit the invasion of hepatocellular carcinoma cells in vitro, but not the proliferation of hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 in vitro.Conclusion　BB-94 can inhibit the growth and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.

　　【Key words】　Inhibitor　　Metalloproteinase　　Extracellular matrix　　Carcinoma, liver　　Tumor invasion　　Tumor metastasis

　　本实验旨在通过本所建立的原位移植的转移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20，就BB-94对HCC生长和侵袭转移的影响及其相关的机制进行研究，为HCC治疗寻找新的途径。现报道如下。

　　材料与方法

　　1. BB-94　BB-94由英国生物技术药品公司提供。用药方法为30 mg/kg体重,腹腔注射，每天1次。

　　2. 原位移植的转移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20　LCI-D20为上海医科大学肝癌研究所于1994年用原位移植方法建立的裸鼠人肝癌高转移模型^［1］。

　　3. SMMC-7721细胞　为肝细胞癌细胞株，由第二军医大学提供。

　　4. 肝和肺转移的观察方法　动物解剖后观察肝脏表面是否有转移灶，每只动物完整的肺包埋于同一石蜡块中，随机切一张进行HE染色，显微镜下观察是否有转移灶形成。

　　5. 明胶酶谱法　根据Kleiner等^［2］方法。上样5 μl,孵育43小时。

　　6. RT-PCR　总RNA抽提使用一步法。逆转录反应体系20 μl,RNA 3 μg，随机引物20 pmol,逆转录酶AMV 10 u，3 μl的2 mmol/L dNTP，Rnasin 20 u，42℃1小时，95℃灭活逆转录酶备用。PCR反应体系25 μl,逆转录产物2.5 μl,意义和反义引物各25 pmol,2.5 μl的2 mmol/L dNTP,Tag酶3 u，94℃变性60秒，48℃退火35秒，72℃延伸75秒，40个循环。意义引物：5′-GGTGATGAAGCAGCCCAG-3′(18 bp);反义引物：5′-CAGTAGAATGGGAGAGTC-3′(18 bp)，扩增438 bp。

　　7. 体外侵袭试验　所用细胞为SMMC-7721细胞，1.5×10⁵个/孔，Mtrigel使用25 μg/6.5 mm直径滤膜，Boyde侵袭小室下室用NIH3T3细胞培养上清，Giemsa染色。BB-94浓度为16 μg/L。

　　8. MTT试验　所用细胞为SMMC-7721细胞，BB-94浓度为0～1500 μg/l,培养72小时。

　　9. 统计方法　两组间均数比较用t检验，两组间率的比较用χ²检验。

　　结果

　　1. BB-94对LCI-D20肿瘤生长及侵袭转移等的影响见表1。

表1　BB-94对裸鼠人肝癌转移模型肿瘤生长与侵袭转移(30天时)及45天生存率的影响

　　2. LCI-D20癌组织中MMPs的表达　明胶酶谱法检测显示LCI-D20组织中存在MMP-2、MMP-9。RT-PCR显示LCI-D20组织中存在MMP-1的mRNA表达，但未见MMP-10的mRNA表达。

　　3. BB-94对SMMC-7721细胞体外侵袭试验的影响　BB-94处理与未处理，每视野穿透Matrigel的细胞数分别为(3.6±3.36)和(22.8±9.09)个/视野，差异有显著性(P＜0.01)。无血浆培养的SMMC细胞上浆经明胶酶谱法测定也可见MMP-2、-9的表达。

　　4. BB-94对SSMC-7721细胞增殖和细胞毒作用的影响　BB-94从0～1500 μg/L的浓度内，经72小时处理后，对SMMC-7721活性细胞数无任何影响。讨论

　　1. BB-94对HCC生长的抑制　肿瘤生长时必须破坏周围正常组织来为其生长提供空间，肿瘤生长到一定大小后又必须有肿瘤血管形成来为其提供营养，而肿瘤细胞对周围正常组织的破坏以及肿瘤血管形成过程中内皮细胞的移行均需要基质金属蛋白酶的参与，因此，基质金属蛋白酶抑制剂可以间接地抑制肿瘤生长。本研究结果显示基质金属蛋白酶抑制剂BB-94可使治疗组人肝癌裸鼠模型的肿瘤组织重量明显低于对照组，而大量研究显示BB-94对体外培养的细胞本身生长并无抑制作用，本研究也显示BB-94对体外培养的HCC细胞系SMMC-7721细胞本身生长并无抑制作用。

　　2. BB-94对HCC侵袭转移的抑制　肿瘤细胞在侵袭过程中需要基质金属蛋白酶对细胞外基质进行酶解，肿瘤细胞在转移过程中要先后经过进出毛细血管两个过程，在这两个过程中肿瘤细胞必须穿过内皮细胞基底膜，而这一过程又必须依赖MMPs尤其是MMP-2、-9对基底膜成分的酶解。

　　3. BB-94在HCC治疗中的应用前景　综合本研究结果，作为MMPs的抑制剂BB-94虽然不能杀灭HCC肿瘤细胞，但对HCC的生长、侵袭和转移均有明显的抑制作用，使得肿瘤处于被“围困”的状态，减少了肿瘤对宿主的侵害。可以用于以下一些情况：(1) 因各种原因无法切除及进行其他治疗，通过MMPs抑制剂使肿瘤处于稳定状态，延长生存期；(2) 因各种原因暂时尚不能手术切除，先通过MMPs抑制剂使肿瘤处于稳定状态，并通过一阶段MMPs抑制剂治疗使肿瘤周围形成一层包膜，待条件允许再行手术切除；(3) 在介入治疗前后使用，抑制肺转移的发生；(4) 用于预防微小残留灶的重新生长。因BB-94产生的治疗作用是药品依赖性的，一旦停止用药其产生的“围困”状态即告解除，因此，在整个试图控制HCC病情发展期间，必须持续用药。

　　本课题为上海市医学领先学科基金和美国中华医学基金会基金(93-853)资助项目

　　参考文献

　　1　Sun FS, Tang ZY, Liu KD, et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues. Int J Cancer, 1996,66:239-240.

　　2　Kleiner D E, Stetler-Stevenson WG. Quantatitive zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Analy Biochem, 1994,218,325-326.

(收稿：1998-02-05)