肿瘤坏死因子α逆转人肝癌多药耐药性的实验研究

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 论著

作者：刘景丰　陈孝平

单位：刘景丰　350050　福州，福建医科大学附属第一医院普外科；陈孝平　同济医科大学同济医院肝脏外科中心

　　关键词： 肿瘤坏死因子α；多药耐药性；逆转；癌，肝细胞

　　【摘要】　目的　探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)作为多药耐药(MDR)逆转剂，特别是作为多重MDR逆转剂的作用及其机制。方法　用本单位建立的肝癌SMMC7721 MDR亚系作为MDR模型，用MTT法观察TNFα对MDR的逆转作用，用RT-PCR、流式细胞术观察TNFα对MDR基因表达的影响。结果TNFα对mdr₁、LRP、GST_P1和TopoⅡα基因介导的耐药性逆转率为87.52%～100%，对MRP基因介导的耐药性无逆转作用，对多重MDR细胞耐药性的逆转率为76.28%～100%。TNFα对mdr₁、LRP、和GST_P1基因的表达有下调作用，对TopoⅡα基因的表达有上调作用，对MRP基因的表达无影响。结论　体外细胞实验证实TNFα为多重MDR逆转剂。

Experimental study of TNFα in reversal of multidrug resistance

LIU Jingfeng, CHEN Xiaoping.

　　Department of Surgery, the 1st Affitiated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005

　　【Abstract】　Objective　To study the role and mlecular mechanism of tumor necrosis facter alpha (TNFα) in reversal of multidrug resistance (MDR).Methods　Reverse rate of (TNFα) to MDR was analyzed by MTT assay, the effect of TNFα on MDR gene expression at mRNA by RTPCR and at proteins by flow cytometry.Results　Reverse rates of TNFa to MDR inducing by mdr₁，LRP，GST_P1 and TopoⅡα gene were 90.09%～100%，by MRP was 0.00%～6.81%. TNFα weakened the mdr₁、LRP and GST_P1 gene expression and enhanced th TopoⅡα gene expression, but had no obvious influence on MRP gene expression.Conclusion　TNFα was proved as a complex-reversal agentin in vitro studies.

　　【Key words】　Tumor necrosis facter alpha　　Multidrug resistance　　Reversal　　Carcinoma, hepatocellular

　　研究多药耐药性(multidrug resistance, MDR)机制的重要目的是寻求逆转耐药的方法。现有的绝大多数逆转剂只能在蛋白水平部分逆转单个基因介导的MDR，且因较大的毒性极大限制了临床应用；对多重MDR逆转剂的研究未见报道。与此同时，在研究细胞因子抗肿瘤作用的过程中，许多资料提示细胞因子能增强抗癌药物对MDR肿瘤细胞的毒性效应^［1］，其作用机制不明确。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNFα)具有多种生物学效应，靶细胞为肿瘤细胞和肝细胞等多种细胞。我们以TNFα为代表，评价其在肝癌MDR逆转中的作用，并探讨作用机制。

　　材料与方法

　　1. MDR细胞模型　用本单位建立的肝癌SMMC7721 MDR亚系作为MDR模型。其中，SMMC7721/DOX、SMMC7721/VCR、SMMC7721/CBP、SMMC7721/MMC和SMMC7721/VP16亚系为单基因MDR细胞模型，分别由mdr₁(multidrug resistance 1)、MRP(multidrug resistance-associated protein)、LRP(Lung resistance-related protein)、GST_P1(glutathione S-transferase P1)和TopoⅡα(topoisomerase Ⅱ alpha)基因介导耐药；多重MDR细胞模型SMMC7721/M亚系的耐药涉及mdr₁、MRP、LRP、GST_P1和TopoⅡα基因。

　　2. 材料　人重组TNFα(美国Promega公司)。GST_P1-1、JBS-1和TopoⅡα鼠抗人单抗(美国Maxim公司)，MRPr1和LRP56鼠抗人单抗(荷兰Flens MJ教授惠赠)。RT-PCR试剂(美国Gibco brl公司)。五种MDR基因及内参照基因(β₂-微球蛋白)PCR引物序列参照文献［2,3］，由上海Sangon公司合成，PAGE纯化。PE2400型PCR仪(美国PE公司)，FACSort型流式细胞仪。

　　3. 观察TNFα对MDR基因表达的影响　分别用5种单基因MDR细胞进行实验。为观察TNFα作用后不同时期MDR基因表达的变化情况，用终浓度为100 IU/ml的TNFα与对数生长期细胞共同孵育，于培养4、8、24、48、72小时后取出细胞进行MDR基因mRNA和蛋白质表达的检测，对照组不加TNFα，实验重复3次。为观察不同浓度的TNFα对MDR基因表达的影响，用终浓度为0、50、100、150 IU/ml的TNFα与对数生长期细胞共同孵育，24小时后取出细胞用于MDR基因mRNA及蛋白质表达的检测，实验重复3次。用二重逆转录PCR方法^［2］检测MDR基因表达，以MDR基因mRNA与β₂-微球蛋白mRNA表达量的比值计算相对表达量。用流式细胞术^［4］检测MDR基因蛋白质表达量，以细胞蛋白质表达阳性率计算表达量。

　　4. 观察TNFα对5种单基因肝癌MDR细胞耐药性的逆转作用　终浓度为150 IU/ml的TNFα分别与MDR细胞共同孵育48小时后，用MTT法^［8］检测抗癌药物的细胞毒性。照下列公式求出逆转率：逆转率=(IC₅₀A-IC₅₀B)/(IC₅₀A-IC₅₀C)×100%，IC₅₀A、IC₅₀B、IC₅₀C分别代表逆转前MDR细胞、逆转后MDR细胞和亲本敏感细胞的IC₅₀值，实验重复3次。

　　5. TNFα对SMMC7721/M多重MDR亚系的逆转实验　在对上述实验结果进行观察的基础上，选用浓度为150 IU/ml的TNFα与多重MDR亚系SMMC7721/M细胞共同孵育48小时，观察MDR基因表达及耐药程度的改变情况。实验重复3次。

　　结果

　　1. TNFα作用后不同时期MDR基因mRNA的表达　TNFα对mdr₁、LRP和GST_P1基因mRNA表达有下调作用，对TopoⅡα基因mRNA的表达有上调作用。TNFα对上述4种MDR基因表达的调节作用存在时间—效应关系，TNFα作用后24小时4种基因mRNA表达量的改变达到最大，持续至48小时，72小时后部分恢复(图1)。TNFα对MRP基因mRNA表达无影响。

图1　TNFα作用后不同时期MDR基因mRNA表达变化趋势

　　2. TNFα浓度对MDR基因mRNA表达的影响　不同MDR基因mRNA对TNFα的敏感程度不同(图2)。当TNFα浓度为100 IU/ml时，GST_P1和TopoⅡα基因mRNA表达恢复到亲本敏感细胞水平。当TNFα浓度为150 IU/ml时，mdr₁和LRP基因mRNA表达量为0，与亲本敏感细胞水平相同。TNFα对上述4种MDR基因表达的调节作用存在剂量—效应关系。鉴于MRP基因在TNFα浓度≤150 IU/ml时其mRNA表达未发生改变，实验中加大TNFα浓度至400 IU/ml，结果仍一样(图3)，进一步证实TNFα对MRP基因表达无调节作用。

图2　不同浓度TNFα对MDR基因的mRNA表达的影响

图3　不同浓度TNFα对MRP基因mRNA表达的影响

　　3. TNFα对MDR基因蛋白质表达的影响见表1。

表1　TNFα对MDR基因蛋白质表达的影响(±s,3例)

　　4. TNFα对单基因MDR亚系细胞耐药性的逆转作用　TNFα对mdr₁基因介导的耐药性(阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙)逆转率为92.71%～99.70%，对LRP基因介导的耐药性(阿霉素、表阿霉素、长春新碱、卡铂、顺铂、苯丙氨酸氮芥、氨甲喋呤、5-氟脲嘧啶)逆转率为90.09%～95.86%，对GST_P1基因介导的耐药性(卡铂、顺铂、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素)逆转率为90.06%～95.70%，对TopoⅡα基因介导的耐药性(阿霉素、表阿霉素、鬼臼乙叉甙)逆转率为92.21%～99.50%，对MRP基因介导的耐药性逆转率为0.00%～6.81%。

　　5. TNFα对多重MDR亚系SMMC7721/M细胞的逆转作用　SMMC7721/M细胞中除MRP基因外其余4种MDR基因mRNA和蛋白质表达水平均恢复到亲本敏感细胞水平(图4)，细胞对抗癌药物的敏感性基本恢复，TNFα的逆转率为76.89%～100%。其中，对与MRP基因介导的耐药有关的抗癌药物阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙的逆转率为76.89%～80.28%，对其它抗癌药物(卡铂、顺铂、苯丙氨酸氮芥、氨甲喋呤、5-氟脲嘧啶和丝裂霉素)的逆转率为91.56%～100%。

图4　TNFα作用后SMMC7721/M细胞MDR基因蛋白质表达直方图

　　1：TNFα作用前　　2：TNFα作用后

　　讨论

　　临床肿瘤患者常存在多重MDR现象，肝癌耐药涉及5种MDR基因，多重MDR是肝癌耐药存在的主要形式。针对单个MDR基因的逆转剂对多重MDR无逆转作用。本实验结果表明，TNFα对目前已知的直接参与介导MDR现象的5种MDR基因的表达有三种不同影响。TNFα对mdr₁、LRP、和GST_PI基因的表达有下调作用，对TopoⅡα基因的表达有上调作用，对MRP基因的表达无明显影响。TNFα影响4种MDR基因的表达存在时间—效应关系和剂量—效应关系，mRNA的表达在TNFα作用后24～48小时之间改变最明显，蛋白质表达的改变要晚于mRNA，于48小时达最大变化。当终浓度为150 IU/ml的TNFα作用于MDR细胞48小时后，4种对TNFα敏感的MDR基因mRNA和蛋白质的表达均恢复到亲本敏感细胞水平，因此，我们用150 IU/ml的TNFα作用于MDR细胞48小时作为最佳逆转条件进行逆转实验，基本完全逆转MDR细胞的耐药性。

　　众所周知，TNFα是迄今所发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最强的一种生物活性因子，估计有效治疗剂量为可允许毒性剂量的5～25倍。本研究在体外细胞实验证实，TNFα可作为多重MDR逆转剂，其作用有以下特点：①逆转效果好，②作用在基因转录水平，③作用有时间—效应和剂量—效应关系，可通过调整TNFα剂量影响逆转效果，④所需剂量小，为引起MDR细胞生长抑制剂量的10%～20%，为引起亲本敏感细胞生长抑制剂量的5%～10%，⑤对mdr₁、LRP、GST_P1和TopoⅡα的作用具有同步性。

　　本课题为福建省重点项目基金资助项目(No.98-2-154)

　　参考文献

　　1　张绍庚，吴孟超，张晓华，等. 肿瘤坏死因子和足叶乙甙治疗肝癌的临床探讨. 中国普通外科杂志，1997，6：65-68.

　　2　Noonan KE, Beck C， Homlzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR₁ (multidrug resistance gene) expression in human tumors by polyemerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:7160-7164.

　　3　Scheffer GL, Wijingaard PL, Flens MJ, et al. The drug resistance-related protein LRP is the human major vault protein. Nat Med, 1995,1:578-582.

　　4　Molinari A, Calcabrini A, Meschinis, et al. Detection of P-glycoprotein in the golgi apparatus of drug-untreated human melanoma cells. Int J Cancer, 1998,75:885-889.

　　5　John RW, Masters EJ, Osborne M, et al. Hypersensitivity of human testis tumor cell lines to chemotherapeutic drugs. Int J Cancer, 1993,53:340-340.

(收稿： 1999-01-31)