复发性肝癌血液AFPmRNA的变化

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 简　报

作者：刘扬　张柏和　钱光相　陈汉　吴孟超　傅继梁　黄长辉

单位：刘扬　张柏和　钱光相　陈汉　吴孟超　200433　上海，第二军医大学东方肝胆外医院；傅继梁　生物教研室；黄长辉　分子生物开放实验室

　　我们通过本研究探讨复发性肝癌血液AFPmRNA表达情况及其与肝癌复发来源的联系，现将结果报道如下。

　　一、对象与方法

　　1. 实验对象　选择在1995年11月～1996年10月收入我院及长海医院康复部的复发性肝癌19例，其中男性17例，女性2例，年龄在45～62岁，平均年龄52.5岁，其血清AFP在400～30000 μg/L(酶联法测定)。以上患者均经B超，CT或MRI检查及血清AFP检测证实为肝癌术后复发，且术前血液AFP均为阳性，肝癌复发时肿瘤直径在2～6 cm之间。同期53例手术切除1年未复发的肝癌患者为对照组，其中男性45例，女性8例，年龄在47～72岁，平均年龄54.3岁，其血清AFP在100 μg/L以下。

　　2. 方法　分别抽取每例患者周围静脉血液5 ml,应用巢式RT-PCR检测血液中AFPmRNA。具体操作如下： (1) 有核细胞的制备： 采用红细胞溶解法^［1］。(2) 抽提细胞总RNA： 采用异硫氰酸胍一步抽提法^［1］。(3) 合成cDNA： 应用Promega公司生产的反转录试剂盒，具体操作按制造商提供的资料进行。(4) 巢式PCR： PCR循环条件参照文献［1］。PCR引物分别设计如下： 外端同义链(EX-sense)： 位于人AFPmRNA外显子1位置(核苷序列中第90-112碱基处)。外端反义链(EX-antisense): 位于人AFPmRNA外显子2位置(核苷序列中第263-241碱基处)。内端同义链(IN-sense)： 位于外显子1和2之间(核苷序列中第122-145碱基处)。内端反义链(IN-antisense): 位于人AFPmRNA外显子3位置(核苷序列中第222-200个碱基处)。具体碱基序列如下：

　　EX-sense5′-ACTGAATCCACAACACTGCATAG-3′

　　EX-antisense 5′-TGCAGTCAATGCATCTTCACCA-3′

　　IN-sense5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′

　　IN-antisense5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGG-3′

　　根据设计要求，首轮PCR产物为174 bp,两轮PCR终产物为101 bp。

　　3. 统计学处理　采用χ²检验。

　　二、结果

　　1. 血液AFPmRNA表达检测　19例复发性肝癌患者中血液AFPmRNA表达阳性者有7例(36.8%)，不表达者有12例(63.2%)。53例未复发的肝癌患者中血液AFPmRNA表达阳性者仅2例(3.6%)。两组比较，差异有显著性意义(P＜0.01)。

　　2. 血清AFP检测　19例复发性肝癌患者中，7例AFPmRNA表达阳性者中有5例血清AFP表达阳性；12例血液AFPmRNA表达阴性者中有10例血清AFP表达阳性。

　　3. 巢式RT-PCR产物鉴定　核酸内切酶PstⅠ可将首轮PCR产物174 bp酶切成102 bp及72 bp两个片段，也可将PCR终产物(101 bp)酶切成60 bp及41 bp两个片段^［1］。

　　三、讨论

　　肝癌术后复发或远处器官转移是肝癌治疗上的一个难点，如何术前预测及术后采取适当的预防措施是当前所面临的一个重要课题。我们曾成功的检测了肝癌患者血液中播散的循环性肝癌细胞，并提出了循环性肝癌细胞是肝癌术后复发或转移的一个重要指征^［1］。

　　本研究表明，19例复发性肝癌中有7例血液AFPmRNA表达阳性(36.8%)，而53例1年内未复发的肝癌患者血液AFPmRNA表达阳性者仅2例(3.6%，P＜0.01)，说明血液AFPmRNA表达阳性的肝癌患者复发率高，推测AFPmRNA与肝癌术后复发或转移有关。在19例复发性肝癌患者中，7例AFPmRNA表达阳性者中有5例血清AFP同时表达阳性；12例血液AFPmRNA表达阴性者中有10例血清AFP表达阳性，说明AFPmRNA不是肝癌术后复发或转移的唯一指标。国外学者Matsumura等^［3］研究表明，肝癌经多种治疗后血液AFPmRNA持续阳性的患者，均在短期内产生了复发或转移性病灶，我们的结果支持这一结论。

　　对于12例复发性肝癌血液AFPmRNA(-)者，其原因分析如下： ① 肿瘤是多中心性发生；② 肿瘤已转移至切除范围以外的肝组织内；③ 血液中不存在播散的肝癌细胞；④ 硬变的肝组织是肝癌发生的温床。其中有4例(血液AFPmRNA阴性及阳性各2例)肝癌复发时血液AFP(-)者，均系肿瘤直径＜3 cm的小肝癌患者。

　　综上所述，复发性肝癌血液AFPmRNA检测有希望成为判断肝癌复发来源的客观性指标之一。

　　注：本课题为军队重点实验基金资助项目

　　参考文献

　　1　刘扬，张柏和，钱光相，等. 巢式逆转录多聚酶链反应检测循环性肝癌细胞及其临床意义. 中华外科杂志，1998，36：608-610.

　　2　Matsumura M, Niwa T, Ogura K, et al. AFPmRNA in blood as a marker to assess the efficacy of the treatments of hepatocellular carcinoma and predict its prognosis. Gastroenterology, 1996,110:1262-1264.

(收稿： 1999-04-10).