Endostatin抑制高转移性人肝癌皮下移植瘤的生长

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 肝癌外科

作者：孙惠川　张明　汤钊猷　李晓明　王鲁　高冬梅　薛琼　陈军

单位：200032　上海医科大学中山医院肝癌研究所(孙惠川、汤钊猷、李晓明、王鲁、高冬梅、薛琼、陈军)；University of Alabama at Birmingham, Birmingham,AL 35294,USA(张明)

　　关键词： 癌，肝细胞；血管形成；血管形成抑制剂；化疗

　　【摘要】　目的　探讨Endostatin对高转移潜能肝癌LCID20生长的抑制作用。方法　LCID20组织植入裸鼠皮下，分别采用不同剂量的Endostatin、顺铂以及二者联合治疗。每5天测量肿瘤的长短径。结果　2mg·kg^-1.d^-1的Endostatin对肿瘤生长无作用，4mg·kg^-1.d^-1的Endostatin和1mg·kg^-1.d^-1的顺铂对肿瘤生长有抑制作用，而联合用药组对肿瘤生长的抑制更强。结论　足量血管形成抑制剂可抑制肝癌 生长；与细胞毒性药物联合应用可提高疗效。

Inhibition of growth of LCI D20 hepatocellular carcinoma by Endostatin

SUN Huichuan, ZHANG Ming, TANG Zhaoyou, et al.

　　Liver Cancer Institute, Zhong Shan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】 Objective To evaluate the inhibitory effect of endostatin on the growth of LCI D20, a highly metastatic hepatocellular carcinoma.Methods Thirty nude mice were subcutaneously implanted with LCI D20 tumor tissues, then treated with subcutaneous injection of 2 mg·kg^-1.d^-1 (group EA) or 4 mg·kg^-1.d^-1 (group EB) Endostatin, or intraperitoneal injection of 1 mg·kg^-1.d^-1 cis-platin (group C), or 4 mg·kg^-1.d^-1 plus 1 mg·kg^-1.d^-1 cis-platin (group EC), or subcutaneous injection of 0.2 mg/d PBS as control. All treatment lasted 40 days after implantation. The tumor size was calculated by using the formula: V=L×W²×0.52.Results The mean tumor size of each group was (8376±2129) mm³ for the control, (6095±2261) mm³ for group EA, (3777±2042) mm³ for group EB, (1629±877) mm³ for group C, and (1248±847) mm³ for group EC, when measured on the day 40 after implantation. Statistical analysis showed that 2 mg·kg^-1.d^-1 Endostatin had no inhibitory effect on the growth of LCI D20, however, 4 mg·kg^-1.d^-1 Endostatin, 1 mg·kg^-1.d^-1 cis-platin and combination of these two drugs delayed the growth of LCI D20. Combination treatment increased the inhibitory effect on the tumor growth, as compared with Endostatin alone.Conclusion Antiangiogenic therapy inhibited the growth of hepatocellular carcinoma. Combination treatment improved the inhibitory effect.

　　【Key words】 Hepatocellular carcinoma Angiogenesis Anti-angiogenesis chemotherapy

　　Endostatin是一种内源性血管形成抑制剂^［1］。LCID20是上海医科大学肝癌研究所建立的高转移潜能人肝癌裸鼠模型^［2］。本实验旨在研究Endostatin对皮下移植的LCID20肿瘤生长的抑制作用。

　　 材料与方法

　　1. 动物模型　6周龄雄性Balb/C nu/nu裸鼠购自中国科学院上海药物研究所。肿瘤源于LCID20皮下传代瘤源。无菌条件下将约1mm×1mm×1.5mm肿瘤组织植入裸鼠右背部皮下。

　　2. 药物　Endostatin由美国Alabama大学Birmingham分校的张明提供。以PBS溶液配制0.2g/L的Endostatin悬浊液，以28.5G注射器反复抽吸，4℃保存。使用前先置于室温30分钟，振荡使之分散均匀。顺铂购自山东齐鲁制药厂，生理盐水配成0.1g/L的溶液，4℃保存。使用前稍加热助其彻底溶解。

　　3. 实验分组　30只皮下移植LCI D20肿瘤裸鼠随机分为5组，每组6只。移植后第1天开始治疗。对照组(Ctl组)皮下注射0.2ml的PBS，每天1次。Endostatin治疗组有2组，EA组为皮下注射0.2ml，每天1次；EB组为皮下注射0.2ml，每天2次。顺铂治疗组(C组)为0.2ml，每天腹腔注射1次。为减少药物毒性并使裸鼠恢复，用药10天后停药5天，再用药，如此循环。Endostatin合用顺铂治疗组(EC)为每天2次的Endostatin和每天1次的顺铂，方法如前。终止治疗时间为对照组裸鼠开始死亡(移植后40天)。每5天测量1次肿瘤的长短径。记录裸鼠状态和肿瘤的形态。肿瘤体积为长径×短径²×0.52。

　　4. 统计学方法　肿瘤体积比较采用t检验。

　　结果

　　1. 对照组肿瘤生长情况　接种后的前5天，肿瘤体积较移植时缩小。5天后体积增加，第20天肿瘤进入快速生长期。可见粗大的血管由周围长入肿瘤内，并有出血坏死灶。第40天时，肿瘤体积平均为8376mm³，裸鼠开始死于巨大的肿瘤负荷。

　　2. Endostatin对肿瘤生长的抑制作用　2mg·kg^-1.d^-1的Endostatin对肿瘤生长几乎无作用。而4mg·kg^-1.d^-1对肿瘤生长有明显的抑制作用。在20～25天肿瘤开始增大，裸鼠正常进食并增加体重，30天出现快速生长期。第40天时平均肿瘤体积：EA组为6095mm³。EB组为3777mm³。统计学检验EB组肿瘤体积与对照组差异有显著性(P＜0.05)。

　　3. 顺铂对肿瘤生长的抑制作用　1mg·kg^-1.d^-1的顺铂明显抑制肿瘤生长。在20～25天肿瘤开始增大，但药物毒性作用明显，裸鼠较对照组和Endostatin治疗组明显消瘦。观察期内亦未见快速生长期。观察末期平均肿瘤体积为1629mm³，与对照组相比差异有显著性(P＜0.05)。

　　4. Endostatin+顺铂对肿瘤生长的抑制作用(图1)　该组肿瘤生长抑制最为明显，观察期内无快速生长期。与对照组和EB组相比肿瘤体积差异有显著性(P＜0.05)，而EC组与C组间差异无显著性(P＞0.05)。此外，肿瘤表面未见明显血管，无坏死出血，外观透明，药物毒性作用与顺铂治疗组相同，在移植后60天裸鼠仍存活。第40天时肿瘤体积平均为1248mm³。

图1　鼠不同治疗组肿瘤体积比较

　　注：Ctl照组，PBS 0.2ml/天；EA组Endostatin 2mg kg^-1天^-1；EB组Endostatin 4mg kg^-1天^-1；C组顺铂1mg kg^-1天^-1;EC组Endostatin+顺铂。

　　讨论

　　为探索有效剂量，我们采用不同剂量Endostatin治疗荷瘤裸鼠，结果2mg·kg^-1.d^-1的Endostatin对肿瘤生长无抑制作用；而4mg·kg^-1.d^-1的Endostatin明显抑制肿瘤的生长，肿瘤生长的“潜伏期”延长到20天，此后进入快速生长期。因此，我们在以后的实验中将Endostatin的剂量定为4mg·kg^-1.d^-1。　　顺铂治疗实验提示1mg/kg体重能有效抑制肿瘤的生长，移植后20天左右进入快速生长期，但药物毒性表现为裸鼠消瘦和贫血。顺铂与Endostatin合用对肿瘤生长的抑制作用强，较单用Endostatin好，无快速生长期。裸鼠虽也较对照组消瘦，但不似顺铂治疗明显，可能由于该组肿瘤负荷没有顺铂治疗组大。在各治疗组中，我们均未观察到肿瘤缩小的现象。我们认为：由于Endostatin不易溶于水，因此须配成稀溶液助溶，有助于吸收，浓度以裸鼠可吸收为原则。Endostatin治疗须足量。作者在预实验时，使用的剂量为2mg/kg体重，肿瘤生长未受到明显抑制。肝动脉结扎和动脉栓塞化疗能抑制肝癌的生长，然而只能阻断大血管，侧枝血管形成使疗效不能持久。新生血管抑制剂能有效阻断侧枝血管形成，故联合使用将更有效。另外，手术切除残留的微小病灶，生长中必定存在活跃的血管形成，此时血管形成抑制剂亦可用于抑制手术后残留病灶的生长，推迟或治愈由于微小病灶引起的临床复发。

　　注：本课题为上海市医学领先专业资助项目(No.983001)

　　参考文献

　　1　OReilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997,88:277-285.

　　2 Sun FX, Tang ZY, Liu KD, et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues. Int J Cancer， 1996, 66:1-5.

(收稿：1999-03-10　修回：1999-06-20)