抗胃癌鼠单抗3H11 Fab段载体的构建、表达及抗体活性检测
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 基因工程抗体
作者：李竞 王琰 王卓智 董志伟
单位：李竞（北京医科大学博士生） 王琰（100037 北京解放军海军总医院）；李竞 王琰 王卓智（北京市肿瘤防治研究所，北京医科大学临床肿瘤学院）；董志伟（中国医学科学院肿瘤研究所）
关键词：抗体；单克隆；抗体；肿瘤；基因；免疫球蛋白；免疫球蛋白可变区Fab
【 摘要 】 目的 构建和表达抗胃癌鼠单抗3H11的Fab段小分子抗体。方法 采用RT-PCR方法，利用第一骨架区通用引物扩增重链Fd段和κ链的基因，克隆到Fab表达载体中。并根据已克隆的3H11 VL的真实序列，重新设计κ链5 ’端引物，将骨架区引物在κ链5’端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列，再次构建Fab表达载体。结果 利用第一骨架区通用引物构建的Fab在大肠杆菌中获得了表达但未检测到抗原结合活性，将骨架区引物在κ链5’端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列后，在大肠杆菌中表达出了可与抗原MGC803细胞结合的Fab段。 结论 在构建小分子抗体时，PCR引物引入的氨基酸残基的改变可影响所表达抗体的活性。
Construction and expression of anti-human gastric cancer McAb 3H11 Fab LI Jing, WANG Yan, WANG Zhuozhi, et al. Navy General Hospital and Beijing Medical University, Beijing 100037
【 Abstract 】 Objective To construct and express the Fab fragment of anti-human gastric cancer McAb 3H11.Methods The cDNAs of κ chain and Fd fragment of anti-gastric cancer McAb 3H11 were amplified with RT-PCR using degenerate primers for framework region 1(FR1) and cloned into an Fab expression vector. The Vκ gene was corrected to its genuine sequence with PCR mediated mutagenesis. 3H11 Fab was expressed in E.coli cells.Results By using the vector containing Fab genes amplified by degenerate primers for framework region (FR1),expression of Fab could be detected but with no antigen binding activity. The reconstructed Fab was expressed in E.coli at a similar level while it could bind to gastric cancer cells and showed same specificity to 3H11 antibody.Conclusions This result indicate that PCR primer introduced V region N terminal changes may seriously affect the antigen binding activity.
【 Subject words 】 Antibodies,monoclonal Antibodies,neoplasm Immunoglobulin variable region
抗体技术的发展经历了多克隆抗血清、单克隆抗体，现已发展到基因工程抗体的阶段，而PCR技术的进展又使免疫球蛋白基因的克隆变得简单易行。利用可变区第一骨架区序列的相对保守性设计通用PCR引物，可简便有效地扩增出各种不同抗体的基因。但通用引物以及为便于克隆所引入的限制性内切酶位点，可在V区氨基端造成氨基酸残基的改变。这些变化是否会影响所构建抗体的活性，有不同的报道〔1，2〕。本文报道在构建抗胃癌鼠单抗3H11 Fab的过程中，轻链PCR引物引入的N端序列变化对Fab活性的影响。
材料与方法
1.材料： 抗胃癌鼠单抗杂交瘤细胞株3H11由本所生化室研制〔3〕，为IgG2b亚类；Fab表达载体p3MH由本室改建自噬粒载体pCOMB3H；大肠杆菌菌株TG1、XL1-blue为本室保存；Tag酶购自Finnzymes公司；限制性内切酶购自Promega公司；HRP-羊抗鼠IgG Fab购自Pierce公司。
2.PCR引物
(1) 通用引物设计：参考文献〔4〕，加以适当合并，见表1。κ链5’端引物MK5 1～3 引入内切酶SacⅠ位点，3'端引物MK3引入XbaⅠ位点；Fd段5'端引物MH5A引入XhoⅠ位点，3'端引物MH3引入SpeⅠ位点。
(2) 定点突变PCR引物：为了修正3H11 κ链扩增时PCR引物所引入的序列改变，根据3H11 VL氨基端的原始序列〔5〕设计了重新扩增κ链的定点突变PCR引物（图1）。
图1 定点突变PCR引物的设计
Fig 1. 5'PCR primers for 3H11 Fab targeted mutagenesis
A.3H11 κ chain N terminal sequence amplified by PCR primers for FR1 (capital letters) and 5'flanking sequence in the vector (small letters)
B.The genuine N terminal sequence of 3H11 Vκ
C.PCR primer for correction of 3H11 κ chain gene
3.RT-PCR法扩增κ链、Fd段：应用美国Gibco BRL公司的Trizol试剂，按照说明书从107 3H11杂交瘤细胞中提取总RNA，以RT-PCR法扩增。
4.3H11 Fab表达载体的构建：PCR产物经琼脂糖电泳分离纯化后，以SacⅠ+XbaⅠ（κ链）或SfiⅠ+XbaⅠ（突变后κ链）、XhoⅠ+SpeⅠ（Fd段）消化，先后重组到载体p3MH相应的内切酶位置中。以相应酶酶切鉴定正确的重组子pMH 3H11。
5.Fab段的表达：将pMH 3H11转化大肠杆菌XL1-blue或TG1，挑取单集落接种于2ml含100μg/ml氨苄青霉素的SB中，37℃培养6小时后加入IPTG至1mmol/L，诱导表达可溶性Fab分子，30℃培养过夜，离心收集上清。
6.可溶性3H11 Fab表达的检测：采用双抗体夹心法，以羊抗鼠IgG Fab（2.3μg/ml）包被ELISA板，1% BSA/PBS封闭，样品为50μl/孔的细菌培养上清，XL1-blue或TG1上清及不同浓度的鼠IgG为阴、阳性对照。加入HRP-羊抗鼠IgG Fab后以OPD为底物显色。每次孵育后均以0.05% Tween20/PBS充分洗涤。
7.3H11 Fab抗原结合活性的检测：以104/孔的密度将人胃癌细胞MGC803接种于96孔板中，37℃培养过夜。弃上清后以0.125% 戊二醛固定细胞，1% BSA/PBS封闭后加入待测细菌培养上清，孵育洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG Fab，以OPD为底物显色。
8.3H11 Fab与3H11 ScFv的竞争抑制试验：以104/孔的密度将人胃癌细胞MGC803接种于96孔板中，37℃培养过夜。弃上清后以0.125% 戊二醛固定细胞，1% BSA/PBS封闭后加入5ng 3H11 Fab，再加HBsAg ScFv或不同量3H11 ScFv作为竞争抑制剂，以不加竞争抑制剂为对照组。孵育洗涤后加入HRP-羊抗鼠Ig Fab，以OPD为底物显色，ELISA reader（Bio-Tek，美国）检测A492吸光度。计算抑制率。
抑制率=100%×（对照组A值－抑制组A值）/对照组A值
结 果
1.3H11 κ链和Fd段的扩增及表达载体的构建：用通用引物以RT-PCR法从杂交瘤细胞中扩增出约700bp的3H11 κ链和Fd段，纯化后以相应酶切重组入p3MH中。酶切鉴定得到正确的重组子pMH3H11（图2）。
图2 Fab表达载体p3MH图谱
Fig 2. Fab antibody expression vector p3MH
Myc:encoding an epitope of decapeptide from human c-Myc gene
His:encoding six histidine for purification of Fab
OmpA and PelB:bacterial leader sequences for secretory expression
2.3H11 Fab的表达及活性的检测：取7个正确重组的pMH 3H11克隆，IPTG诱导表达后取细菌培养上清分别做Fab段表达和与胃癌细胞系结合的ELISA检测。结果如表2，7个克隆均有Fab的表达，表达量约为50～100ng/ml。但7个克隆均不能与胃癌细胞系MGC803结合。
3.3H11 κ链的改造：上述表达的3H11 Fab段没有抗原结合活性，促使我们考虑是否由于5端引物引入的氨基端序列改变所造成〔4，5〕。根据Padlan的报道〔8〕，V区氨基端残基，尤其轻链氨基端残基可涉及抗体的抗原结合部位的构象。我们根据3H11 VL原始序列〔2〕设计引物（表1），通过PCR介导的定位突变，利用载体VL 5端侧翼的SfiⅠ位点，将κ链氨基端第1、2及4位氨基酸残基矫正为3H11原始序列，所获表达载体pMH3H11N经限制性内切酶谱分析核实。
表1 构建鼠Fab的PCR引物
Table 1. PCR primers for mouse Fab antibody
| 5' Primers for mouse Fab |
| κ : MK51 CCAGTTCCGAGCTCGTGMTSACMCAGTCTCCA |
| MK52 CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA |
| MK53 CCAGATGTGAGCTCGTSATGACCCAGWCTCCA |
| Fd: MH5A AGGTSMARCTKCTCGAGTCWGG |
| 3' Primers for mouse Fab |
| κ:MK3 GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA |
| Fd:MH3 GCATGGACTAGTGGGGTTGATTGTTGAAAT |
（W=T/A,R=A/G,S=C/G,Y=C/T,M=C/A)
表2 大肠杆菌表达之3H11 Fab的ELISA分析
Table 2. Analysis with ELISA for E.coli expressed 3H11 Fab
| Clone |
Fab expression |
MGC803 binding |
| 1 |
1.218±0.012 |
0.169±0.001 |
| 2 |
1.163±0.177 |
0.167±0.011 |
| 3 |
1.196±0.112 |
0.178±0.002 |
| 4 |
0.695±0.015 |
0.137±0.001 |
| 5 |
0.905±0.168 |
0.144±0.006 |
| 6 |
1.689±0.100 |
0.212±0.026 |
| 7 |
0.997±0.052 |
0.149±0.002 |
| Mouse Ig(50ng/ml) |
0.769±0.045 |
- - |
| Mouse Ig(100ng/ml) |
1.269±0.124 |
- - |
| 3H11 McAb(10ng/ml) |
- - |
0.750±0.004 |
| 3H11 McAb(100ng/ml) |
- - |
2.140±0.008 |
| TG1 supernatant |
0.022±0.001 |
0.138±0.012 |
4.矫正后3H11 Fab表达及活性的检测：随机选取7个克隆，诱导表达后取细菌培养上清做Fab段表达和抗原结合活性的检测，结果如表3，7个克隆均有Fab的表达，表达量约为50～100ng/ml。且7个克隆均可与胃癌细胞系MGC803结合。
表3 矫正后3H11 Fab的ELISA分析
Table 3. Analysis with ELISA for recorrected 3H11 Fab
| Clone |
Fab expression |
MGC803 binding |
| 1 |
1.300±0.086 |
0.592±0.022 |
| 2 |
1.178±0.113 |
0.507±0.061 |
| 3 |
0.789±0.168 |
0.350±0.009 |
| 4 |
1.150±0.091 |
0.539±0.039 |
| 5 |
1.287±0.116 |
0.508±0.028 |
| 6 |
1.040±0.021 |
0.365±0.011 |
| 7 |
0.960±0.008 |
0.562±0.005 |
| Mouse Ig(50ng/ml) |
0.769±0.045 |
- - |
| Mouse Ig(100ng/ml) |
1.269±0.124 |
- - |
| 3H11 McAb(10ng/ml) |
- - |
0.750±0.004 |
| 3H11 McAb(100ng/ml) |
- - |
2.140±0.008 |
| TG1 supernatant |
0.022±0.001 |
0.138±0.012 |
5.3H11 Fab与3H11 ScFv的竞争抑制试验：为核实3H11 Fab的结合特异性，需进行竞争抑制实验，由于3H11鼠单抗与Fab段无法用HRP-抗鼠IgG区分，我们选用了与3H11 ScFv〔已证实与亲本鼠单抗具有相同特异性（结果待发表）〕，取一定量的3H11 Fab，与不同量的3H11 ScFv混合，进行与胃癌细胞MGC803的竞争抑制性ELISA反应。结果如表4所示，3H11 Fab与胃癌细胞的结合可被3H11 ScFv所抑制，提示它们识别相同的抗原决定簇。
表4 3H11 ScFv与Fab的竞争性ELISA实验
Table 4. Competition ELISA of 3H11 ScFv with 3H11 Fab
| 3H11
Fab(ng) |
3H11
ScFv(ng) |
HBsAg
ScFv(ng)* |
A492 |
Inhibition
(%) |
| 5 |
- |
- |
0.451±0.006 |
0 |
| 5 |
- |
100 |
0.426±0.030 |
5.5% |
| 5 |
10 |
- |
0.359±0.009 |
20.4% |
| 5 |
20 |
- |
0.340±0.003 |
24.6% |
| 5 |
40 |
- |
0.320±0.015 |
29.0% |
| 5 |
60 |
- |
0.297±0.007 |
34.1% |
| 5 |
80 |
- |
0.254±0.001 |
43.7% |
| 5 |
100 |
- |
0.202±0.005 |
55.2% |
*HBsAg ScFv used as control
讨 论
利用基因工程技术对鼠杂交瘤抗体进行改造是现今工程抗体制备、新型抗体开发的热点，RT-PCR技术因其简便有效性已成为克隆单抗可变区基因的主要手段。目前文献报道主要利用位于第一骨架区的通用引物进行抗体可变区基因的克隆，这将不可避免地使扩增出的可变区氨基端不能完全忠实于原序列，这些变动有可能影响抗体分子的结合活性〔6〕。
在我们构建3H11Fab的过程中，利用通用引物PCR扩增Fab段，克隆入载体后未获得特异结合抗原的阳性克隆，我们考虑PCR扩增时引入的可变区氨基端序列的改变可能是其原因〔6，7〕。对比3H11的原始序列〔5〕，我们所构建3H11 Fab中κ链氨基端有2～3个氨基酸残基的改变（图1）。根据15个已知小鼠Fab段的立体构象数据，14/15个VL氨基端的氨基酸残基第1位，15/15个第2位，12/15个第3位及15/15个第4位与CDR平面有密切接触，可影响抗体-抗原的结合〔8〕。而我们所克隆的3H11 κ链恰好改变了第1，2，4位氨基酸残基，因此我们通过PCR介导的定位点突变矫正了3H11 κ链的氨基端序列，结果矫正后的Fab段在大肠杆菌中的表达量与矫正前相似，而抗原结合活性得到了恢复。我们在以前3H11 ScFv构建过程中曾发现3H11 V区氨基端序列对ScFv活性表达的关键性作用〔9〕，但因条件所限不能确定是因影响了大肠杆菌的分泌型表达还是影响了CDR区的立体构象。本工作证明了3H11κ链氨基端序列的变化影响了抗体和抗原的结合（很可能是影响了CDR的构象），而并非影响细菌的分泌性表达。
在构建3H11 Fab的过程中我们还偶然发现，仅仅单独κ链的表达即有抗原结合活性，但矫正前的κ链却只有表达而无抗原结合活性，与完整Fab段所得到的实验结果相同。在一般的文献报道中认为，VH对抗原的结合起主要作用，并被称为单区抗体，可单独结合抗原，而单独轻链则几乎不能与抗原结合〔10〕。我们的结果证明单独轻链有时也可与抗原结合。
我们在对3H11 Fab的表达中还发现，不同大肠杆菌菌株在表达量和所表达出抗体片段的活性上会有所不同，TG1在表达量上略优于XL1-blue，而在所表达出抗体片段的活性上则明显优于XL1-blue。这可能由于不同大肠杆菌菌株胞浆和质周腔内环境不同，对抗体片段的表达、折叠、包装和分泌有不同的影响。因而在小分子抗体的表达中，试用不同的菌株可能会有意想不到的结果。
参考文献
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(收稿：1997-10-13 修回：1998-02-17)
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