胃癌c-erbB-2基因扩增的荧光原位杂交检测
临床与实验病理学杂志 1999年第5期第15卷 论著
作者：彭文明 周敏能 麦卫阳 郑秀玲 方云光 黄锐明
单位：彭文明 周敏能 麦卫阳 郑秀玲 方云光 黄锐明（广州市第二人民医院病理科 510150）
关键词：胃肿瘤；原癌基因；c-erbB-2；原位杂交；荧光
摘要 目的：研究胃癌c-erbB-2基因扩增。方法：使用荧光原位杂交技术(FISH)检测55例胃癌。结果：胃癌肿瘤区c-erbB-2基因扩增阳性率为36.4%。在胃癌移行区内阳性率为10.9%，在正常粘膜区阳性率为3.6%，相互比较，三个区域之间差异有高度显著性(P＜0.01)。在肠型和弥漫型胃癌，c-erbB-2基因扩增阳性率为51.6%和16.7%，两者差异有显著性(P＜0.05)。c-erbB-2基因扩增阳性与淋巴结内胃癌转移有明显相关性(P＜0.05)。结论：c-erbB-2基因扩增与胃癌的发生，发展有明显关联，有助于判断胃癌预后。
分类号 R735.2 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)05-0411-03
Detection of c-erbB-2 gene amplification in human gastric carcinoma by fluorescence in situ hybridization
Peng Wenming, Zhou Minneng, Mai Weiyang et al
(Second Peoples Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510150)
ABSTRACT Purpose To investigate c-erbB-2 gene amplification in gastric carcinoma.Methods Fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to detect c-erbB-2 gene amplification from 55 cases of gastric carcinoma tissues.Results The positivity rates of c-erbB-2 gene amplification in cancer tissues was 36.4%. The positivity rate of c-erbB-2 gene amplification in transitional areas of tumors were 10.9%, and those of c-erbB-2 gene amplification in normal mucoepithelium regions of tumors were 3.6%. There were significantly difference among three areas (P＜0.01 or 0.001). The positivity rates of c-erbB-2 gene amplification in intestinal type and diffuse type of gastric carcinoma were 51.6% and 16.7% respectively. There was {ignificantly difference between two types (P＜0.05). The positivity rate of c-erbB-2 gene amplification was related to lymph node metastasis of gastric carcinomas (P＜0.05).Conclusion c-erbB-2 gene amplification is related to development and progression of gastric carcinoma, which might be useful in evaluating patients prognosis.
KEY WORDS stomach neoplasms; proto-oncogenes; c-erbB-2; in situ hybridization,fluorescence
荧光原位杂交技术(fluorscence in situ hybridization, FISH)曾用于细胞遗传学染色体的分析〔1〕，近年被用于肿瘤基因分析研究〔2，3〕。我们应用FISH技术检测胃癌和癌旁组织c-erbB-2基因表达情况，并分析其与胃癌的发生、分类、分级和淋巴结转移的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集我院1996～1998年胃癌根治术切除的标本55例，其中男性34例，女性21例。＜50岁者11例，＞50岁者44例，平均年龄61.1岁。每例标本按肿瘤区，移行区(距肿瘤边缘0.5～1 cm)和正常区取材，10%福尔马林固定，常规脱水包埋，切片厚4 μm，HE染色。按照Lauren组织学分类：肠型31例，弥漫型24例。按WHO分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级13例，Ⅲ级23例。淋巴结转移35例。
1.2 试剂 c-erbB-2生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂配制：(1)20×SSC：88.2 g枸椽酸钠，173.3 g NaCl加水至1 000 ml，高压灭菌。(2)变性液：28 ml去离子甲酰胺，4 ml 20×SSC，8 ml蒸馏水。(3)PBD液：用下列液代替，1 000 ml 20×SSC， 加1.25 g Tween 20，相当于5×PBD。
1.3 FISH 切片厚＜4 μm，置于硅烷玻片上60℃过夜。脱蜡至80%乙醇，晾干：2×SSC洗，5 min×3次；0.2 mol·L-1盐酸10 min；2×SSC， 5 min×3次；250 mg·L-1蛋白酶K室温30 min；2×SSC洗，5 min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8 min后快速入-20℃ 70%～100%乙醇脱水，各2 min，晾干；同时将配好的含有c-erbB-2探针的杂交液85℃变性5 min，然后放在0℃冰浴10 min；滴加探针杂交液，每片15～20 μl，用盖片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，加入50%甲酰胺，45℃，10 min；入2×SSC，40℃，5 min；入2×SSC，37℃，5 min；PBD室温 2 min；每片滴加15～20 μl FITC标记的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃，30 min；PBD 2 min×3次;滴加15～20 μl生物素结合的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃，30 min；PBD 2 min×3次；再加15～20 μl FITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒37℃， 30 min；PBD 2 min×3次；滴加PI/Antifade，每片20 μl(避光)，直接封片，5 min后，荧光镜检。
1.4 对照 (1)正常胃粘膜组织；(2)用2×SSC代替探针杂交液作对照。
1.5 观察 用Olympus BX60荧光显微镜观察(滤镜WB，激发波长490～600 nm)。判断结果：癌细胞核中有4个以上斑点状黄绿色荧光则说明该基因有扩增，定为阳性。
1.6 统计学处理 率的比较用χ2检验。
2 结果
2.1 阳性细胞成群分布，在弥漫型胃癌中荧光信号稍强，肠型胃癌中，其信号稍弱。
2.2 c-erbB-2基因扩增在55例胃癌区域分布中，肿瘤区内c-erbB-2基因扩增20例，阳性率36.4%；移行区内扩增6例，阳性率10.9%；正常区内，扩增2例，阳性率3.6%，在三个区域中分别比较，P＜0.01或P＜0.001，差异有非常显著性。c-erbB-2基因扩增与胃癌组织学分型、分化程度和淋巴结转移的关系见附表：在胃癌组织分型中，肠型胃癌c-erbB-2基因扩增16例(51.6%)，弥漫型胃癌扩增4例(16.7%)，两型胃癌之间比较，差异有显著性(P＜0.05)。在分化程度上，c-erbB-2基因扩增阳性在各级之间分别比较，仅见1级与3级之间有显著性(P＜0.05)。在逐级比较中，差异无显著性(P＞0.05)。在与淋巴结转移的关系中，转移癌c-erbB-2阳性17例(48.6%)，无转移者阳性3例(15%)，相互比较(P＜0.05)有统计学意义。
表1 c-erbB-2基因扩增与胃癌组织分类、
分级和淋巴结转移的关系
| 项 别 |
检测例数 |
c-erbB-2扩增例数(%) |
| 组织学类型 |
|
|
| 肠型 |
31 |
16(51.6) |
| 弥漫型 |
24 |
4(16.7) |
| 分化程度 |
|
|
| 1级 |
19 |
3(15.8) |
| 2级 |
13 |
5(38.5) |
| 3级 |
23 |
12(52.2) |
| 淋巴结转移 |
|
|
| 有 |
35 |
17(48.6) |
| 无 |
20 |
3(15.0) |
3 讨论
国外学者应用免疫组化等方法研究胃癌组织中c-erbB-2蛋白的表达〔4～6〕，以此间接反映c-erbB-2基因的激活，其结果不尽相同。我们采用FISH技术检测胃癌c-erbB-2基因扩增，其原理与其Southern印迹杂交相同，以变性的DNA单链作为模板，用另一DNA探针与其碱基互补生成杂交复合体发出荧光。该探针带有生物素荧光标记作为阳性反应，可用于细胞和组织切片，说明有关核酸序列的位置状况及染色体中特定基因的位置〔7，8〕。同其他分子生物学技术比较，FISH避免了肿瘤内非实质性细胞对实验结果的干扰。不仅能对阳性信号直接做出较准确的定位，还能对阳性信号作出定量分析〔9〕。c-erbB-2基因是位于17号染色体上的原位基因，c-erbB-2基因的激活或扩增与胃癌的发生关系密切〔5，6〕。本实验用FISH检测胃癌肿瘤区内c-erbB-2基因表达阳性率为36.6%，表明c-erbB-2基因的扩增与激活，使得胃上皮细胞生长、分化的调控发生了改变，因此在胃癌的发生上起着重要作用。本组检测发现胃癌的移行区，正常粘膜区c-erbB-2基因扩增阳性率分别为10.9%和3.6%，反映了c-erbB-2基因激活在胃癌癌变过程中起动较早，提示代表癌前病变或胃粘膜上皮细胞的高度增殖状态，可能对癌前病变的研究有一定意义。
本组结果还发现c-erbB-2基因扩增阳性率在肠型胃癌为51.6%，明显高于弥漫型(16.7%)，在两型之间差异存在显著性(P＜0.05)，提示c-erbB-2基因扩增阳性与两型的组织学发生起源有关。在c-erbB-2基因扩增阳性与胃癌分化程度的关系中，仅见高、低分化癌之间有明显差异(P＜0.05)，但在逐级比较中差异无显著性(P＞0.05)，表明c-erbB-2基因扩增与癌的分化高低有关，但不能作为分级的参数。在分析与淋巴结转移的关系中，c-erbB-2基因扩增阳性与淋巴结胃癌转移呈正相关，对胃癌的预后有一定意义。
作者简介：彭文明，男52岁，副主任医师。研究方向：胃肠道肿瘤病理，尤其擅长外科病理诊断
参考文献
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9，张 杰，陈乐真，吕亚莉等. Her/2neu基因扩增及其蛋白表达与乳腺癌分化和转移的关系. 中华病理学杂志，1997；26(1)：46～47
收稿日期：1998-12-30
修回日期：1999-07-02
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