As₂O₃诱导人胃癌细胞凋亡的研究

　　第二军医大学学报1999年第20卷第9期

　　蔡洪培　邓志华　李石　张兴荣　沈建伟　刘苏

　　摘　要　目的：观察As₂O₃对人胃癌细胞 株 的作用，并探讨其抗胃癌作用的机制。方法： 不同浓度进口分析纯A s₂O₃ 0.1～2.0 μmol/L与人胃癌细胞株共育一定时间后，观察细胞的 存活、形态学改变及细胞DNA含量的分布，并以NIH3T3细胞作对照。结果：1.0～2.0 μmol/L As₂O₃处理的胃癌细胞呈典型的凋亡特征性改变：在形态上 表现为胞膜完整、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；流式细胞术分析显示在G₁期细胞 前出现亚二倍体峰，与As₂O₃作用的时间及浓度呈正相关趋势。结论：As₂O₃抗胃癌作用机制之一可能是诱导胃癌细胞凋亡。

　　关键词：三氧化二砷　胃肿瘤　凋亡

　　胃癌严重危害人类健康，据WHO统计，胃癌的发病率在消化道肿瘤中居于第一位^［1］ 。近年来 ，随着诊断技术的进步，使得早期胃癌的治疗取得了令人满意的疗效，但对大多数中晚期肿 瘤，化疗的效果仍不尽如人意。80年代初，国内中医孙鸿德等^［2］首先使用含砒霜 的中药制剂治疗白血病，特别是急性早幼粒细胞性白血病(APL)，发现砒霜制剂能使APL缓解 ，与其他化疗药之间无交叉耐药性。此后砒霜治疗白血病逐渐为广大临床工作者所接受。 90年代初，国内唐伟等^［3］对砒霜治疗白血病细胞的作用进行了大量的实验及临床 研 究，指出砒霜是通过诱导APL细胞凋亡而发挥治疗作用的。砒霜治疗APL的成功为恶性肿瘤的 治疗提供了一条新思路。本研究旨在探讨As₂O₃对胃癌细胞株的作用，以期为砷剂治疗 胃癌提供实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　人胃癌细胞株SGC7901和MKN45，由中国科学院上海细胞生物学研究 所提供。 小鼠成纤维细胞NIH3T3由本院实验科提供。DMEM培养基：Gibco公司产品。小牛血清：华 美生物工程公司产品，56℃ 30min灭活。进口As₂O₃：相对分子质量197.84，Sigm a公司产品，用PBS配成10 mmol/L贮备液，4℃保存。琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、Hind Ⅲ Ma rker均为华美公司产品。流式细胞仪：Coulcer公司。CO₂孵箱：德国Heraeus公司。

　　1.2　细胞培养　SGC7901和MKN45细胞在5% CO₂，37℃孵箱中培养，培养液DM EM含10%热灭 活小牛血清、100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素。细胞培养密度为(0.5～1.0)×10⁶ 个/ml，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

　　1.3　药物处理　预实验发现，2 μmol/L As₂O₃具有诱导细胞凋亡的作用。本实 验用倍比稀释，设立5个摩尔浓度(0.1～2.0 μmol/L)进行观察，并以不加药为对照组。

　　1.4　活细胞计数　取30 μl细胞悬液加2%锥虫蓝染液混匀后在细胞计数板上计数。

　　1.5　形态学观察　在培养状态下，用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变， 观察细胞凋亡过程。并将1.0 μmol/L处理24 h的细胞用苏木精-伊红(HE)染色观察细 胞凋亡情况。

　　1.6　流式细胞仪分析　细胞与1 μmol/L的As₂O₃共同孵育5 d，PBS清洗2次，加 无水乙醇固定24 h，随后清洗细胞，与含1% RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育10 min，碘化丙锭 (PI) DNA染色，流式细胞术分析不同DNA含量的细胞分布，资料由LysisⅡ软 件收集、贮存和分析。

　　1.7　DNA抽提及电泳　1×10⁶细胞经1.0 μmol/L As₂O₃处理5 d，将细胞移 入1. 5 ml离心管，加裂解液及蛋白酶K，55℃水浴20 min后，加RNA酶10 μl，作用2 min; 酚、 氯仿-异戊醇各抽提1次，加醋酸钠无水乙醇，放于液氮10 min；70%乙醇抽干DNA，用TE溶 解DNA，取抽提好的DNA 5 μl，在1.8%琼脂糖凝胶5 V/cm电压条件下电泳3 h，302 nm紫外 光透照，观察电泳条带。

　　2　结　果

　　2.1　As₂O₃对细胞生长的影响　As₂O₃分别与2×10⁴细胞SGC7901、MKN45细胞共同孵育，细胞生长受到抑制，这一抑 制作用随药物浓度的提高及作用时间的延长而明显增加；而对NIH3T3细胞却无明显抑制作 用(表1，2)。

表1　不同浓度As₂O₃作用不同时间对SGC7901细胞的影响

　　Tab 1　The effects As₂O₃ on the growth of SGC7901 cells at different time and concentration

表2　不同浓度As₂O₃作用不同时间对MKN45细胞的影响

　　Tab 2　The effects As₂O₃ on the growth of MKN45 cells at different time and concentrations

　　2.2　细胞形态学变化　正常情况下，SGC7901及 MKN45 细胞呈多角形，贴壁生长。在As₂O₃作用下，细胞逐渐 变圆，折光性及贴壁能力减弱，细胞核染色质深染，聚集于核膜下呈新月形，细胞膜突起呈 小泡样，小泡脱落形成凋亡小体。NIH3T3细胞形态学上无变化(图1)。

　　2.3　DNA琼脂糖凝胶电泳　可见凋亡梯形条带（SGC7901及 MKN45 细胞）和基因 组条带（NIH3T3细胞）。

图1　As₂O₃ 处理24 h后细胞形态学变化(苏木精-伊红染色，×40)

　　Fig 1　Cell morphorlogical changes after 24 h treatment of As₂O₃ (HE，×40)

　　A: SGC7901 ; B: MKN45 ; C: NIH3T3

　　2.4　流式细胞术检测出现凋亡峰　二株胃癌细胞在As₂O₃ 作用后，经PI染色DN A 流式细胞术检测，发现在G₁期细胞峰前，出现亚二倍体凋亡峰，且随着As₂O₃浓度 的升高和作用时间的延长，细胞凋亡的百分数增加，细胞的凋亡量与S期的细胞数有关，As ₂O₃可诱导细胞进入S期，并促进其凋亡。图2为两株胃癌细胞经1.0 μmol/L As₂O₃作用5d后的流式细胞术检测结果。

图2　1 μmol/L As₂O₃ 作用5d后流式细胞术分析

　　Fig 2　The analysis of flow cytometery after 5d treatment of 1 μmol/L As₂O₃

　　A: SGC7901 ; B: MKN45

　　3　讨　论

　　肿瘤无限增殖的恶性生物学特征与肿瘤细胞的无限增殖及(或)细胞死亡减少有关。近年来， 随着人们对凋亡分子机制的深入研究，认识到增加肿瘤细胞凋亡是一条有效的治疗肿瘤的途 径，并成为人们关注的热点^［4］ 。许多抗肿瘤化疗药物通过细胞毒作用破坏肿瘤细 胞^［5］， 但化疗药之间可产生交叉耐药性而降低化疗效果并增加毒性作用^［6］ 。砷剂在治疗 白血病时 与其他化疗药之间无交叉耐药性，其高缓解率是其他化疗药无可比拟的^［7］。本 实验证明进 口分析纯As₂O₃能明显抑制胃癌细胞的生长，这种抑制作用实际上是通过促进细胞进入S期并 诱导其凋亡而实现的：2.0 μmol/L的As₂O₃作用48 h后流式细胞仪检测发现，正常对 照组S期细胞占30%，无凋亡发生，而加药组S期细胞占58%，细胞凋亡率为61%，说明砷剂是通过 诱导细 胞进入S期而促进细胞凋亡。HE染色发现凋亡的细胞表现为染色质浓缩、呈块状聚集、形成 新月形；而包膜并不破裂，胞浆细胞器完整；凋亡通过细胞出泡方式形成许多由质膜包裹的 镜下可见的凋亡小体。细胞在凋亡过程中，DNA被核酸酶裂解成小片段(180～200 bp)，在琼 脂糖凝胶电泳时形成梯形条带。

　　As₂O₃诱导胃癌细胞凋亡还随着浓度的升高及作用时间的延长而更加明显，存在剂量- 时效关 系。而对小鼠成纤维细胞NIH3T3虽也有生长抑制作用，但抑制生长、诱导凋亡较肿瘤细胞 株而言需明显增加浓度及延长时间。肿瘤细胞较正常体细胞增生明显活跃，因而在增殖过程 中吞噬的As₂O₃颗粒的量较正常细胞多，这种As₂O₃颗粒通过细胞内机制而发挥作用 ，其可能 的机制是：(1)灭活巯基酶：某些富含半胱氨酸的蛋白酶，如白细胞介素1β转化酶（ICE ）是凋 亡的效应分子之一，砷与蛋白质和氨基酸分子中的巯基具有较强的亲和性，能影响巯基酶 的活性；或其直接与蛋白质的巯基结合，使蛋白质灭活，引起细胞代谢异常、发生细胞凋亡 ；(2)细胞内游离Ca²⁺升高：As₂O₃可使细胞膜通透性增加，使细胞内游离Ca ²⁺升高，可抑制GJIC功能，使细胞增殖能力减弱^［8］；(3)诱导凋亡基因Fas、Fas -L表达；抑制bcl-2表达。王振义^［9］发现As₂O₃能下调NB4细胞bcl-2的表达 ，使bcl-2/bax比值减少，并认为这是诱导细胞凋亡的最终途径。As₂O₃诱导胃癌细胞 凋亡是否也通过此途径，还值得进一步研究。

　　一般认为砷的中毒剂量为10～50 mg，致死量为60 mg^［10］。砷剂治疗白血病已用于临床，但 对消化道肿瘤的治疗还未见报道。另外，以往的实验大多采用含砷的中药制剂，其主要成分 为雄黄和砒霜，前者为AsS, 后者为As₂O₃。为精确观察复合制剂单一成分As₂O₃ 对胃癌细 胞株的影响，本实验采用了进口分析纯As₂O₃，发现As₂O₃不但明显抑制胃癌细胞生长，并且能诱导胃癌细胞凋亡，这就提示我们可以在内镜下将有效剂量的As₂O₃注入肿块内，抑制肿 瘤生长，为手术创造条件，可能有一定的作用。另外对腹腔转移瘤，可试将As₂O₃腹腔 内注射，发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而减少腹水的形成，这有待以后的动物实验及临床 观察进一步证实。

　　作者简介：蔡洪培，男，1966年9月生，博士，主治医师

　　作者单位：第二军医大学长征医院消化内科，上海，200003

　　参考文献

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　　2　孙鸿德, 马　玲, 胡宵晨, 等. 癌灵一号结合中医辨证治疗急性早幼粒细胞白血病32 例　［J］. 中国中西医结合杂志. 1992, 12(3):170

　　3　唐　伟, 陈国强, 史桂英, 等. 三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞株的双重效 应研究［J］.中华医学杂志, 1997,77(7):509

　　4　Hino N, Higashi T, Nouso K. Apoptosis and proliferation of human hepatocellul ar carcinoma［J］. Liver , 1996,16(2):123

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　　7　Thomas LA. Arsenic and apoptosis in the treatment of APL［J］. J Natl C ancer Inst, 1998,90(2):86

　　8　杨新中, 林淑芬, 刘士清. 砷剂治疗白血病概况［J］. 中医杂志, 1997, 38(1):51

　　9　王振义. 开展砷剂治疗白血病的临床和机制研究［J］. 中华血液学杂志, 1996,17(2) :57

　　10 倪建华, 陈国强, 沈志祥, 等. 静脉滴注三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的药 代动力学分析［J］. 中华血液学杂志, 1995,5(18):251