MGr1抗体筛选文库获得胃癌耐药相关的新基因片段

世界华人消化杂志 1998年第8期第0卷 Original Articles

作者：时永全　肖　冰　苗继延　李明峰　乔泰东　陈宝军　陈　峥　韩军良　周绍娟　樊代明

单位：第四军医大学西京医院消化疾病研究所　陕西省西安市　710033

关键词：胃肿瘤/病理学；肿瘤细胞，培养的；药物筛选试验，抗肿瘤；抗体，单克隆；多药耐药性

A novel cDNA fragment associated with gastric cancer drug resistance screened from a library by mAb MGr1

SHI Yong-Quan, XIAO Bing, MIAO Ji-Yan, LI Ming-Feng, QIAO Tai-Dong, CHEN Bao-Jun, CHEN Zheng, HAN Jun-Liang, ZHOU Shao-Juan and FAN Dai-Ming

　　Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, Forth Military Medical University, Xi＇an 710033， Shaanxi Province, China

　　Subject headings　stomach neoplasms/pathology; tumor cells, cultured; drug screening assays, antitumor; antibody, monoclonal; multidrug resistance

　　Abstract

　　AIM　To prepare gastric cancer multiple drug resistance (MDR) associated monoclonal antibody (mAb) MGr1, and to screen tumor drug resistance cell epitope library with MGr1, so as to obtain novel cDNA fragment associated with tumor MDR.

　　METHODS　By hybridoma technique, gastric cancer MDR associated mAb MGr1 was prepared using gastric cancer MDR cell strain SGC7901/ VCR as immunogen. Tumor drug resistance cell epitope library was screened and rescreened using MGr1 as a probe. The cDNA fragment brought by the positive recombinant was sequenced forward and backward, then, homology analysis was undertaken within GenBank. The expression level of positive cDNA fragment in several types of tissues and cells was determined with in situ hybridization and Northern blot.

　　RESULTS　Twenty-six clones of hybridoma whose supernatant had the ability to bind SGC7901/ VCR were obtained from 3268 clones after 21 times cell fusing. And one mAb of interest, which was named MGr1, was selected by immunohistochemistry and MDR reversal test of mAb. MGr1 stain was stronger on SGC7901/ VCR than on SGC7901, and could enhance the cytotoxity of 5-FU and ADR on SGC7901/ VCR. Western blot showed that the Mr of MGr1 was 80 000-110 000, which could not be recognized by Pgp or MRP antibody. Therefore MGr1 could be regarded as gastric cancer MDR associated mAb. By library screening, five bacterial clones showed affinity to MGr1, and one clone was confirmed to have positive recombinant after being screened repeatedly. The cDNA fragment brought by the positive recombinant, which was named MGr1-Ag, had 310 bp and showed no homology with other genes in GeneBank. Results of in situ hybridization suggested that the normal tissues of liver, esophagus, stomach, colon did not express the MGr1-Ag. Results of Northern blot suggested that the MGr1-Ag was expressed in SGC7901, SGC7901/ VCR, EC109 and HCC7402. The expression level of MGr1-Ag was very high in SGC7901/ VCR, but low in EC109 and even lower in SGC7901 and HCC7402.

　　CONCLUSION　Gastric cancer MDR associated mAb MGr1 was successfully prepared; and a novel cDNA fragment associated with gastric cancer MDR, MGr1-Ag was obtained by screening tumor drug resistance cell epitope library with MGr1.

　　中国图书资料分类号　R 979.1

　　摘　要

　　目的　制备胃癌多药耐药相关性单克隆抗体(mAb)，并以该抗体筛选肿瘤耐药细胞表位文库，以获得肿瘤耐药相关的新基因片段.

　　方法　采用杂交瘤技术，以胃癌耐药细胞株SGC7901/ VCR为免疫原制备胃癌多药耐药相关性,mAbMGr1，并以MGr1作为探针对肿瘤耐药细胞表位文库反复进行筛选；对稳定阳性重组子所携带的cDNA片段进行正反向测序，并将测序结果输入GeneBank进行同源性分析；原位杂交与Northern blot检测阳性克隆在不同组织细胞中的表达.

　　结果　经过21次融合获得了26株培养上清能与SGC7901/ VCR结合的杂交瘤克隆，经免疫组化和单克隆抗体逆转耐药实验发现其中一株mAb在SGC7901/ VCR膜表面及胞内的表达显著高于其相应的药物敏感细胞SGC7901，并能部分逆转SGC7901/ VCR对ADR和5-FU的耐药性. Western blot表明该mAb对应的抗原Mr 800 000～110 000，与Pgp和MRP不同，该株mAb被命名为MGr1. 以MGr1筛选文库，获得了5个能与MGr1抗体结合的携带阳性重组子的菌落，经反复筛选后，证实有一个稳定的阳性克隆；正反向测序结果表明该阳性cDNA片段长度为310 bp，GeneBank检索显示该片段无任何同源性；原位杂交表明该基因在肝、食管、胃、大肠的正常组织均未见表达，Northern blot证实该基因在胃癌细胞SGC7901，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR，食管癌细胞EC109，肝癌细胞HCC7402中均有表达，但在SGC7901/ VCR中的表达量显著高于其他细胞.

　　结论　成功地制备了胃癌耐药相关性mAbMGr1. 以MGr1抗体筛选肿瘤耐药细胞表位文库获得了一个与胃癌耐药相关的新基因片段.

　　0　引言

　　肿瘤细胞在接触化疗药物后，可以获得对结构和功能各不相同的多种药物的耐受性，即多药耐药性(multidrug resistance, MDR). 有些肿瘤细胞也可以天然地产生MDR. 目前认为，主要有3种机制介导MDR^［1］： ①细胞内药物蓄积减少；②细胞核内拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPOⅡ)活性减低；③细胞质中GST/ GSH解毒功能增强. 其中第一种机制的研究最为深入. 已经成功地发现和克隆3种具有药物外流泵功能的跨膜蛋白：P-糖蛋白(P-glycoprotein, Pgp)，多药耐药相关性蛋白(multidrug-resistance associated protein, MRP),肺耐药相关性蛋白(lung resistance-related protein, LRP). 它们的组织表达、表达调控、与患者预后的相关性以及相应的逆转措施被广泛地研究探讨. 但上述发现尚不能完满解释肿瘤MDR的产生及不同的耐药细胞在耐药机制和交叉耐药谱型上的差异. 为了深入研究肿瘤MDR现象和发现新的MDR机制，我们成功地诱导建立了人胃癌耐药细胞株SGC7901/ VCR，现利用SGC7901/ VCR作为免疫原制备胃癌MDR相关性单克隆抗体(mAb)MGr1，并以MGr1筛选由樊代明教授构建的肿瘤耐药细胞表位文库^［2］，以期获得与肿瘤MDR相关的新的基因片段.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　胃癌细胞SGC7901，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR，食管癌细胞EC109，肝癌细胞HCC7402，小鼠骨髓瘤细胞SP2/ 0均为本所保存的细胞. ♀健康Balb/ c小鼠，4 wk～10 wk，由本校动物中心提供. 肝、食管、胃、大肠的正常组织及胃癌组织标本各30例均取自本院近期外科手术之新鲜标本. 辣根过氧化物酶(HRP)标记的大鼠抗小鼠IgG、小鼠抗人Pgp抗体、小鼠抗人MRP抗体、DAB、地高辛标记的dUTP(DIG-dUTP)、硝酸纤维素滤膜、蛋白酶K，DEPC，MOPS，MTT，PMSF均为Sigma公司产品. RPMI1640，HEPES，L-谷胺酰胺为Gibco公司产品. 探针标记试剂盒、异硫氰酸胍、限制性内切酶BamHⅠ,KpnⅠ，胎牛血清皆购于华美生物工程公司. ［^α-³²P］dATP购于北京亚辉公司. 高范围蛋白标准参照物(212 000，116 000， 97 000， 66 000， 57 000，40 000)为Promega公司产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1　mAb的制备　SGC7901/ VCR 1×10⁷细胞与福氏完全佐剂ip Balb/ c小鼠，d 14以相同数量的细胞ip加强免疫，d 35以相同数量的细胞分别ip与iv强化免疫，3 d后小鼠脾脏分离淋巴细胞. 脾淋巴细胞与SP2/ 0骨髓瘤细胞的融合参照文献［3］进行. 采用免疫组织化学方法和酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆. 免疫组织化学选用胃正常组织和癌组织的石蜡切片及SGC7901和SGC7901/ VCR细胞扒片. 酶联免疫吸附实验选用SGC7901和SGC7901/ VCR分别包被的96孔板. 阳性克隆MGr1经有限稀释法3次亚克隆后，部分冻存细胞种，部分用以制备腹水.

　　1.2.2 免疫组织化学　各组织切片常规脱蜡至水，封闭内源性酶，MGr1腹水(1∶500)作为一抗于37℃结合60min，HRP标记的大鼠抗小鼠IgG(1∶800)作为二抗于37℃结合30min，最后以DAB作为底物于37℃显色. 出现棕黄色颗粒为阳性，根据颜色的深浅分别记为弱阳性、阳性、强阳性. 制备SGC7901/ VCR细胞的超薄切片，在电子显微镜下观察MGr1相应的抗原在耐药细胞中的分布.

　　1.2.3 Western blot　细胞蛋白粗提液的制备参照文献［4］，SDS-PAGE采用80 g/ L分离胶和50 g/ L积层胶. 蛋白电泳结束后，以电转移的方法将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上，并将滤膜置于50 g/ L脱脂奶粉于室温封闭30min. 之后，分别结合一抗(MGr1或Pgp及MRP)二抗(HRP标记的大鼠抗小鼠IgG)，最后以DAB显色阳性条带.

　　1.2.4 MTT实验　参照文献［5］进行MTT实验，以确定MGr1能否增强ADR或5-FU对SGC7901/ VCR的细胞毒性.

　　1.2.5 文库筛选与复筛　将携带文库的大肠杆菌涂于琼脂平板(主板)上并在37℃培养至肉眼可见的菌落出现，以粘贴法将主板上的菌落转移至硝酸纤维素滤膜上，并将主板置于37℃培养箱继续培养至菌落出现. 将滤膜贴于另一含IPTG(10 mol/ L)的琼脂平板并置42℃诱导培养3 h～4 h，氯仿固定滤膜上诱导的融合蛋白，并予裂解液裂解，再以50 g/ L脱脂奶粉封闭，常规结合一抗(MGr1)和二抗(HRP标记的大鼠抗小鼠IgG)，最后以DAB显色. 将主板与膜上显色的阳性斑点相对应的菌落挑选出来，并扩增培养. 将扩增后的细菌涂于琼脂平板，再以MGr1抗体筛选. 反复筛选直至某一菌落在下一轮的扩增筛选中全部显示阳性结果，即认定该菌落为一稳定的阳性克隆.

　　1.2.6 阳性重组子的鉴定及cDNA测序　将阳性克隆菌扩大培养，提取并纯化其所携带的阳性重组子. 资料表明，肿瘤耐药细胞表位文库构建于pEX载体多克隆位点的BamHⅠ和KpnⅠ之间，因此，用BamHⅠ和KpnⅠ酶切阳性重组子，琼脂糖凝胶电泳观察所释放的cDNA片段的大小，并以冻融法^［6］回收cDNA片段，以制备杂交探针. 以pUC载体通用引物对阳性重组子所携带的cDNA片段进行正反向全自动测序.

　　1.2.7 基因同源性分析　通过Internet网，检索GeneBank和EST库，比较阳性cDNA片段与已发现基因或基因片段的同源性.

　　1.2.8 组织原位杂交　30例食管、胃、肝、大肠的正常组织标本石蜡切片，常规脱蜡至水，封闭内源性酶. 以随机引物法制备DIG-dUTP标记的MGr1-Ag cDNA片段作为探针，进行预杂交、杂交、显色，显微镜下观察结果.

　　1.2.9 Northern blot　收集生长状态良好的SGC7901，SGC7901/ VCR，EC109，HCC7402各1×10⁷细胞，按一步法^［6］提取总RNA，热变性后行甲醛变性凝胶电泳，真空抽吸法转移RNA至硝酸纤维素滤膜上. 以随机引物法制备同位素［^α-³²P］dATP标记的MGr1-Ag cDNA片段作为探针，进行预杂交、杂交及自动显影.

　　2　结果

　　2.1　mAb MGr1的制备与鉴定　经过21次细胞融合有3268个杂交瘤克隆长出，其中有26个克隆显示了与SGC7901/ VCR的结合性，经免疫组织化学及MTT实验筛选，最后获得了胃癌耐药相关的mAbMGr1. 免疫组织化学结果显示，MGr1在SGC7901/ VCR细胞上着色明显多于SGC7901细胞(图1)，在30例组织标本中，只有一例胃癌组织显示强阳性，一例正常胃粘膜显示弱阳性. 电镜结果显示，MGr1相应抗原既表达在SGC7901/ VCR的胞膜上，也表达在SGC7901/ VCR的胞质中(图2). Western blot表明MGr1相应抗原Mr约为80 000～110 000，它不能被Pgp或MRP相应抗体识别(图3). MTT实验显示MGr1能部分逆转SGC7901/ VCR对ADR或5-FU的耐药性(图4).

　　2.2 阳性cDNA片段的克隆与鉴定　在原始文库中，大约有5 000 000个克隆被筛选，其中有5个克隆显示与MGr1抗体阳性结合. 在随后的反复筛选中，只有一个克隆稳定地与MGr1抗体结合. 以BamHⅠ和KpnⅠ消化阳性重组子，琼脂糖凝胶电泳显示所释放的阳性cDNA片段约为0.3kb(图5). 测序结果表明该片段含有一个起始密码子，其部分序列如下：

　　GAGACTATTTTTTCCTTGCTCTTTAAAGGAATCCAAAGTT

　　CTCCTAGTAAGTTGAGCACCTACAGAAACTTTATAAAGAC

　　TTACTCCCTGAATTACTGCCACATCATACAAAATAGAAGC

　　TTTATAACCTGCAGAAGTTTATGTAACTGCACAACTGCA.

　　检索GeneBank和EST库结果表明该cDNA片段与目前已经登录的基因或基因片段无任何同源性.

　　2.3 组织原位杂交　肝、食管、胃、大肠的正常组织标本均未显示任何杂交信号.

　　2.4 Northern blot　SGC7901 cells，SGC7901/ VCR cells, EC109 cells， HCC7402 cells均显示杂交信号，以SGC7901 /VCR最强，EC109次之，SGC7901和HCC7402较弱(图6).

图1　以免疫组织化学法鉴定mAb MGr1

　　a.MDR cells SGC7901/VCR is strongly positive ×400　　B.SGC7901 is weakly positive ×400图2　MGH抗原在胃癌耐药细胞SGC7901/VCR胞膜及胞浆的分布×5000　　MDR cells strain SGC7901/ VCR ×5000图3　蛋白电泳和西方印迹

　　1.Protein Marker　2 & 3. SGC7901/ VCR extractions　4.MGr1 antibody, Mr 80 000～110000　5.Pgp and MRP antibodies, Mr 170 000, 190 000图4　SGC7901/VCR细胞对ADR、5-FU或VCR的药物敏感性图5　1%琼脂糖凝胶电泳显示MGH阳性cDNA片段

　　1.SGC7901/ VCR　2.SGC7901　3.EC109　4.HCC7402

　　3　讨论

　　肿瘤MDR严重影响化疗效果. 目前主要将肿瘤MDR归因于跨膜转运蛋白引起的药物外流及细胞内药物蓄积减少. 在已发现的跨膜转运蛋白中，Pgp是被研究得最为充分的一个^［7］，它在许多肿瘤组织中被发现，并被作为逆转多药耐药的主要靶蛋白. 新近，另外两个跨膜转运蛋白，MRP和LRP，在非Pgp介导的肿瘤耐药细胞中被发现和克隆. MRP和LRP在细胞膜的表达影响着细胞内的药物蓄积和分布^［8］. 将MRP和LRP的基因转入药物敏感细胞，该细胞即呈现耐药表型. Pgp，MRP和LRP均属于ABC (ATP binding cassette)家族成员，它们结合并水解ATP以获得转运蛋白或药物的能量. 肿瘤细胞可以通过其中一种或几种转运蛋白而产生MDR^［9］. Pgp，MRP和LRP既表达于肿瘤组织又表达于一些正常组织^［10］. 研究发现，Pgp表达于肾脏、肾上腺、脑血管、肌肉、肺、胰腺、肝脏、小肠、胎盘和睾丸，MRP表达于肾、肾上腺、肺、胰腺、肌肉、小肠、胸腺、前列腺，LRP表达于肾、肾上腺、心脏、肺、肌肉、胸腺、前列腺、骨髓和睾丸. 这提示三种转运蛋白可能在正常的蛋白分泌和转运中扮演着重要的角色. 表达转运蛋白的正常组织发生肿瘤后，即天然地产生MDR. 除此之外，Pgp还表达于除肺癌、胃癌、食管癌、头颈部肿瘤和肉瘤以外的其他肿瘤^［11］；MRP主要表达于胃癌、大肠癌和肺癌^［12］；LRP主要表达于白血病细胞和黑素瘤细胞^{［13，14］}. 临床研究表明，Pgp,MRP和LRP在肿瘤组织中的表达水平与患者的预后呈正相关. 但是，Pgp,MRP和LRP并不能完满解释肿瘤多药耐药现象的产生和不同耐药细胞在耐药机制及交叉耐药谱型上的差异. Lee JS et al^［15］用ADR在维拉帕米(verapamil)存在的情况下诱导人乳腺癌细胞系MCF-7产生MDR，免疫印迹和PCR结果表明在耐药细胞株MCF-7/VpAd中并无Pgp和MRP表达增加. 实验还证实，Pgp和MRP在Jurkat T淋巴瘤的天然耐药中并不起重要作用^［16］. 一些细胞骨架蛋白和钙离子通道的亚单位在一些研究中显示与肿瘤MDR有关^{［15，17］}. 这表明，肿瘤MDR的产生是一个受多因素、多机制调节的过程. 因此，很有必要去寻找新的MDR相关分子.

　　胃癌对化疗药物的反应性通常很差. 为了研究胃癌MDR现象，作者采用大剂量间歇诱导法以长春新碱(VCR)诱导人胃癌细胞SGC7901产生耐药性，耐药细胞株SGC7901/ VCR同时对5-FU、顺铂、柔红酶素产生交叉耐药. 我们利用SGC7901/ VCR作为免疫原采用杂交瘤技术成功地制备了肿瘤耐药相关性单克隆抗体MGr1. 免疫组织化学结果表明，MGr1相应抗原在SGC7901/ VCR上的表达显著高于SGC7901. 电镜显示MGr1相应抗原既表达在SGC7901/ VCR的胞膜上又表达在其胞质中. MGr1相应抗原Mr为80 000～110 000，它不同于Pgp(170 000)和MRP(190 000)，也不能被Pgp或MRP相应抗体识别. MTT实验显示MGr1抗体能部分逆转SGC7901/ VCR对ADR和5-FU的耐药性. 这表明，MGr1是肿瘤耐药相关性单克隆抗体. 以MGr1作为探针筛选肿瘤耐药细胞表位文库，获得了一个长310bp新基因片段，它的序列中包含一个起始密码子，不含终止密码子，并且该基因片段与GenBank和EST库中其他已发现的基因或基因片段无任何同源性. 杂交结果表明，该基因片段在正常的食管、胃、肝、大肠组织中无表达，但表达于它们的癌细胞系，其中以胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR表达最多. 这就表明所获得的基因片段与胃癌耐药相关.

　　我们成功地制备了胃癌耐药相关性单克隆抗体MGr1，以MGr1作为探针筛选肿瘤耐药细胞表位文库，获得了与肿瘤MDR相关的新基因片段. 进一步克隆其全长cDNA，将有可能发现一个新的肿瘤MDR相关基因，从而充实MDR机制，并为从基因水平寻找新的逆转耐药措施奠定坚实的基础.

　　时永全，男，1973-11-03生，1996年第四军医大学毕业，医学学士，1996年考取第四军医大学西京医院消化内科硕士研究生，研究课题为肿瘤相关基因的克隆与肿瘤基因治疗.

　　国家杰出青年基金资助项目，No.3952020.

　　通讯作者　樊代明，710033，第四军医大学西京医院消化疾病研究所，陕西省西安市长乐西路15号.

　　Project supported by the state fund for outstanding young scientists, No.3952020.

　　Correspondence to:FAN Dai-Ming, Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, Forth Military Medical University, 15 Changle Xilu, Xi＇an 710033， Shaanxi Province, China

　　Tel. +86·29·3232971-72863(O)

　　收稿日期　1998-06-06

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