干扰素α等对白细胞介素2活化的脐血体外杀伤白血病细胞株的增强作用

中华儿科杂志 1998年第11期第0卷 论　　著

作者：续岩　郭在晨　于载泺

单位：100034 北京医科大学第一医院儿科

关键词：胎血；细胞活素类；白血病；肿瘤细胞；培养的

　　【摘要】　目的　评价干扰素α(IFN-α) 、肿瘤坏死因子α（TNF-α）对白细胞介素2（IL-2）活化的脐血体外杀伤白血病细胞株作用的影响。方法　采用³H-TdR掺入法和半固体培养法。结果　三种细胞因子中仅IL-2可活化脐血产生对体外培养的白血病细胞株的杀伤作用；IFN-α、TNF-α与IL-2联合应用，可产生协同效应，其杀伤率明显高于单用IL-2活化组4到10个百分点； IL-2单独或联合INF-α，不影响脐血造血祖细胞的活性（PCA），TNF-α单独或联合IL-2应用则对PCA有明显抑制作用，抑制程度在60%左右。结论　INF-α、TNF-α均能协同IL-2活化脐血，提高活化脐血的抗肿瘤活性；IFN-α联合IL-2不影响脐血PCA。

　　The influence of interferon α and TNF-α on the killing effect of IL-2 activated cord blood on leukemia cell strains in vitro　Xu Yan, Guo Zaichen, Yu Zaile. Department of Pediatrics, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the influence of interferon-α(IFN-α) and TNF-α on the killing effect of interleukin 2 (IL-2) activated cord blood on CEM and K562 cell strains.Methods　［³H］-TdR release assay and semisolid culture method were used in this study.Results　Among the three cytokines, only IL-2 was able to activate cord blood to generate anti-tumor activity. IFN-α and TNF-α played the synergetic role with IL-2 during activation. Coculturing with either of the two cytokines, the killing ratio of activated cord blood was significantly improved by 4 to 10 percent. IL-2 alone or cooperated with IFN-α did not inhibit progenitor cell activity (PCA) of activated cord blood, but TNF-α alone or cooperated with IL-2 did. The inhibition degree was about 60%.Conclusion　TNF-α and IFN-α could cooperate with IL-2 to activate cord blood to kill leukemia cells. Using IL-2 together with IFN-α for activation did not inhibit cord blood PCA, which could benefit hematopoiesis reconstitution.

　　【Keywords】　Fetal blood　　Cytokines　　Leukemia　　Tumor cells, cultured

　　白细胞介素2（IL-2）、干扰素α（IFN-α）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）是目前生物反应调节疗法中常用的细胞因子。IL-2活化的骨髓（ABM）可在体内外杀伤各种肿瘤细胞，同时保持其造血祖细胞的活性（PCA）。ABM的抗肿瘤活性可被IFN-α、TNF-α所增强。脐血是干细胞的另一来源，可代替骨髓进行移植，被IL-2活化的脐血（ACB）也具有抗肿瘤活性。加入IFN-α、TNF-α后能否增强ACB对白血病细胞的杀伤能力？以上细胞因子的联合应用对脐血的PCA有何影响？对此我们进行了体外研究。

材料和方法

　　一、标本来源

　　1. 15例脐血标本取自本院产房，母婴均健康，足月顺产。自胎盘侧用血袋采集脐血，脐血采集量最少为45 ml。1号抗凝液（含枸橼酸、枸橼酸钠）抗凝，标本在6小时内处理。

　　2. CEM细胞株（人T淋巴细胞白血病细胞株）、K562细胞株（人慢性粒细胞白血病细胞株急性变）由北京医科大学血液病研究所提供。

　　二、主要试剂及材料

　　IL-2购自北京邦定生物制品有限公司 。胰蛋白酶（1：250）为美国Gibco公司产品。DNA酶由华美公司提供。³H-胸腺嘧啶核苷由中国原子能公司提供。INF-α和TNF-α购自军事医学科学院。

　　三、实验方法

　　1. 脐血单个核细胞（MNC）制备：应用密度梯度离心法从收集的脐血中获得单个核细胞，再用RPMI-1640+10%胎牛血清(FCS)培养液分别配成1×10⁶/ml 浓度细胞悬液以备用。

表1　6份不同细胞因子培养不同时间的脐血对CEM细胞株的杀伤率(±s,%)

　　注：与空白对照组比较，^* P＜0.05;相同条件下不同培养时间杀伤率比较，^** P＜0.01；与IL-2组比较，^△ P＜0.05；相同条件下不同培养时间杀伤率比较，^△△ P＜0.01　　2. 活化脐血制备 ：依照培养时所加细胞因子的不同，实验组分为IL-2、INF-α、TNF-α、IL-2+INF-α及IL-2+TNF-α共5组。细胞因子的浓度参照文献［1］选用，IL-2为500 U/ml、IFN-α为1000U/ml、TNF-α为1 000 U/ml。分别培养24小时和72小时收获的单个核细胞即为活化脐血细胞，用RPMI-1640液洗涤1～2遍后，调细胞浓度分别为1×10⁷/ml、5×10⁶/ml、1×10⁶/ml。空白对照组为不加细胞因子的同样培养体系。

　　3. 靶细胞的制备：取对数生长期的CEM、K562细胞各5×10⁵/ml，每毫升加入³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)370 kPq (10 μCi)，37℃，5% CO₂，饱和湿度培养2小时，RPMI-1640液洗涤1～2遍后调为1×10⁵/ml悬液备用。

　　4. ³　H-TdR前标记掺入法测定杀伤功能：在96孔培养板微孔池内分别加入脐血细胞、CEM细胞及K562细胞悬液各100 μl，实验效靶比（脐血MNC：白血病细胞）为10：1、50：1、100：1。37℃，5%CO₂，饱和湿度培养18小时。冷却后分别加入1.8%胰酶和0.15%DNA酶各20 μl，37℃作用30～60分钟后将各孔细胞分别收集到玻璃纤维滤纸上，用液闪计数器上测定其每分钟闪烁计数，结果取3孔平均值。

　　5. 经不同细胞因子激活的脐血祖细胞生成活性测定：按本室常规半固体培养方法进行。培养第7、10天计数粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)集落（＞40个细胞）数。

　　四、统计学分析

　　应用医学统计软件SPSS处理。计量资料用±s表示，用方差分析、q检验和t检验进行数据分析。

结果

　　一、IL-2、IFN-α及TNF-α单独刺激的脐血对白血病细胞株的杀伤作用

　　体外，脐血经IL-2 活化24小时即可产生对CEM和K562细胞株的杀伤作用，杀伤率明显高于未加细胞因子培养的脐血组（空白对照组）（P＜0.05）。活化72小时，杀伤率进一步增强，差异具有显著意义（P＜0.05）。无论培养24小时还是72小时，IFN-α、TNF-α均不能诱导脐血产生对白血病细胞株的杀伤作用，其杀伤率与空白对照组比较无明显差异（P＞0.05），说明单独应用IFN-α及TNF-α不能激活脐血（表1、2）。

　　二、IL-2与IFN-α、TNF-α联合激活的脐血对白血病细胞株的杀伤作用

　　应用IL-2与IFN-α、TNF-α共同活化脐血24小时后，发现效应细胞对两种靶细胞株的杀伤作用均有明显增强，其杀伤率较IL-2单独活化的脐血组杀伤率提高4到9个百分点，差异具有显著意义（P＜0.05）。活化72小时后，激活的脐血的抗肿瘤活性进一步增强，杀伤率较24小时进一步提高4到10个百分点，差异均有显著意义（P＜0.05）。各实验组数据显示，IL-2+IFN-α组效应细胞对不同靶细胞的杀伤率较IL-2+TNF-α组高，但差异不具有显著性（P＞0.05）。

　　三、不同效靶比、不同活化时间活化脐血对白血病细胞株的杀伤作用

　　结果表明，IL-2、IL-2+IFN-α及IL-2+TNF-α组，

表2　6份不同细胞因子培养不同时间的脐血对K562细胞株的杀伤率(±s,%)

　　注：与空白对照组比较，^* P＜0.05;相同条件下不同培养时间杀伤率比较，^** P＜0.01；与IL-2组比较，^△ P＜0.05；相同条件下不同培养时间杀伤率比较，^△△ P＜0.01　　活化的脐血对白血病细胞株的杀伤率随效靶比的增加而增加，即呈效靶比依赖关系。活化时间由24小时延长至72小时，其杀伤率也随之明显提高。在本实验中，活化时间为72小时，效靶比100：1时，效应细胞对靶细胞的杀伤率最大。

　　四、细胞因子的应用对脐血造血祖细胞活性的影响

　　1. IL-2、IFN-α和TNF-α单独刺激脐血对其PCA的影响：脐血与IL-2共同培养1天和3天，其PCA活性不受影响，CFU-GM、BFU-E计数与空白对照组比较无明显差异（P＞0.05）。

　　脐血与IFN-α、TNF-α共同培养1天和3天，表现出粒单系和红系集落生成受到明显抑制，集落数量明显减少，生成的集落也多小于空白对照组，差异具有显著意义（P＜0.05）。其中TNF-α对脐血PCA活性的抑制更为显著，培养1天，脐血粒单系集落生成减少53%、红系减少60%，培养3天较培养1天又有明显减少，以红系为著（减少70%），差异均有显著意义（P＜0.05）。

　　2. IL-2与IFN-α、TNF-α联合刺激脐血对其PCA的影响：与IFN-α单独应用不同，与IL-2+IFN-α培养1天和3天后，脐血PCA未受到明显抑制，其CFU-GM、BFU-E值明显高于IFN-α组（P＜0.05），与空白对照组比较则无明显差异（P＞0.05）。

　　IL-2+TNF-α组表现出与TNF-α相同水平的抑制作用，培养1天脐血粒单系及红系集落生成较对照组明显减少，培养3天较培养1天进一步降低，以红系更为显著，差异均有显著意义（P＜0.05）。

讨论

　　生物反应调节疗法是治疗肿瘤的新途径。于1989年Agah等^［2］首次提出了活化骨髓（ABM）的概念：即指在体外经白细胞介素2激活，具有杀伤多种体内、外恶性肿瘤细胞能力的骨髓细胞，其细胞毒活力不受白细胞主要相容抗原(MHC)的限制，能杀死自然杀伤细胞(NK)敏感或抵抗，及放、化疗不敏感的多种肿瘤细胞，且不损伤正常细胞，细胞仍有造血祖细胞活性，保持着在体内重建造血的能力。进一步的研究显示，IL-2、IFN-α和TNF-α均能明显增加ABM对肿瘤细胞的杀伤力^［1］。

　　骨髓移植（BMT）是治疗白血病和某些实体瘤的重要手段，由于无法彻底清除患者体内的微小残留病（MRD）而使移植后肿瘤复发率较高。继物理、化学药物和单克隆抗体等体外净化骨髓的方法应用后，国外学者将ABM的方法用于BMT中取得了可喜的效果。而细胞因子联合活化的骨髓较ABM具有更强的骨髓净化和清除MRD的作用，是生物反应调节治疗的新趋势，目前的研究工作刚刚起步。

　　脐血富含造血干细胞，是造血干细胞移植的另一来源。脐血细胞免疫功能均有不成熟的特性。这也是脐血移植（CBT）中移植物抗宿主反应（GVHD）弱的主要原因^［3］。与此相关的是其移植物抗白血病作用（GVL）也有可能降低，对此目前尚无定论。如何增强脐血GVL作用，将细胞因子活化的脐血应用于CBT是一可行的途径。以往的研究表明，IL-2可成功地激活脐血而产生明显的抗肿瘤活性。本实验发现，IL-2联合IFN-α、TNF-α活化的脐血组具有较IL-2单独活化组更强的杀伤白血病细胞株的作用。这提示我们，CBT中存在的弱的GVL作用有可能被细胞因子IL-2活化，特别是IL-2联合IFN-α、TNF-α更能活化脐血。而细胞因子间的协同作用，既能提高治疗效果，同时也可减少用药剂量、缩短用药时间、减轻毒副作用。特别是对于CBT，在保持弱的GVHD反应的同时，又能增强其GVL作用。

　　通过研究不同细胞因子对脐血PCA的影响，我们发现IFN-α虽对此有一定的抑制作用，但IFN-α与IL-2联合应用组并没有PCA受抑制的表现，这表明二者的联合应用在增强效应细胞抗肿瘤作用的同时，又能保持脐血的造血活性。TNF-α对脐血PCA有着较强的抑制作用，并呈时间依赖关系。TNF-α与IL-2联合应用，结果仍是如此。因此我们认为，如果联合应用TNF-α和IL-2，应有选择地适当缩短活化时间或减小TNF-α的用量，这样才有可能既发挥其增强GVL的作用，又避免过度损伤造血祖细胞而影响造血功能的重建。

　　IFN-α、TNF-α具有免疫调节、抗增殖、抗肿瘤等作用。Dickinson等^［4，5］发现IL-2明显增加骨髓中NK细胞和细胞因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞的活性，而IL-2与IFN-α或TNF-α联合应用后，细胞毒活性进一步增强，CD⁺₃、CD⁺₈、CD⁺₂₅、CD⁺₅₆细胞增加。IFN-α及TNF-α协同IL-2活化脐血杀伤白血病细胞株，推测其机制可能与细胞因子网络调控，脐血细胞中效应细胞（包括NK细胞、杀伤性T细胞等）增加，细胞毒活性增强有关。

　　IFN-α、TNF-α可协同IL-2活化脐血杀伤白血病细胞。IFN-α与IL-2联合应用既可以增强活化脐血的抗肿瘤活性又能维持脐血的PCA，在临床上将有应用前景。

　　参考文献

　　1　Charak BS, Agah R, Gray D, et al. Interaction of various cytokines with interleukin-2 in the generation of killer cells from human bone marrow: application in purging of leukemia. Leuk Res, 1991, 15:801-810.

　　2　Agah R, Malloy B, Kerner M, et al. Generation and characterization of IL-2 activated bone marrow cells as a potent graft vs. tumor effector in transplantation. J Immounol, 1989, 143:3093-3099.

　　3　Keever CA, Abu-Hajir, Graf W, et al. Characterization of the alloreactivity and anti-leukemia reactivity of cord blood mononuclear cells. Bone Marrow Transplant, 1995, 15: 407-419.

　　4　Dickinson AM, Middleton SL, Latham J, et al. Cytokines treatment of human bone marrow activates anti-leukemia effector cells: moniting of purging by polymerase chain and DNA analysis. Leukemia, 1995,9 :444-449.

　　5　Robertson MJ, Manley TJ, Donahue C, et al. Costimulatory signals are required for optimal proliferation of human natural killer cells. J Immunol, 1993, 150:1705-1714.

(收稿：1998-01-22　　修回：1998-06-20)