香龙散诱导人胃癌细胞凋亡的机理探讨
中医杂志 2000年第7期第41卷 实验研究
作者：杨勤建 雷良蔚 李波 潘希雄 郑从义
单位：湖北中医学院，湖北省武汉市武昌区云架桥110号(430061)
关键词： 胃肿瘤；中医药疗法；@ 香龙散
摘要 应用荧光染色法、电镜、流式细胞术、DNA凝胶电泳和免疫组化法研究中药香龙散含药血清诱导人胃癌细胞(HS-746T)的凋亡和对Bc1-2、BaX、P16基因表达的影响。结果香龙散含药血清在5%的浓度剂量时，作用细胞24小时，去含药血清，再加入无含药血清的培养液培养36小时，细胞凋亡达到高峰，凋亡率为37.02%，大部分细胞阻滞在S期；可使Bc1-2基因表达减弱，Bax、P16基因表达增强。结果表明,香龙散含药血清可诱导人胃癌细胞凋亡，并影响凋亡相关基因的表达。
细胞凋亡(又称程序性细胞死亡)是在体内、体外因素作用下，由多基因参与调控的一种生理现象。近年来研究表明,肿瘤的发生、发展与细胞凋亡的调控异常有关。本研究在中医理论指导下，选用中药复方香龙散，通过血清药理学方法和分子生物学实验技术，从分子水平观察了其对人胃癌细胞的诱导凋亡作用以及对凋亡相关基因表达的影响，探讨其作用机理。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 含药血清的制备：中药香龙散：由炒白术、半夏、天龙(壁虎)、九香虫等10余味中药组成，生药由湖北省药材公司饮片厂提供。动物：日本大耳白兔，雄性，体重2.5～3kg，由同济医科大学实验动物学部提供。用日本大耳白兔5只，每日给予含香龙散浸膏10g/kg灌胃，10日后，于最后1次灌药后2小时(灌药前禁食不禁水12小时)，乙醚麻醉，颈动脉取血，无菌分离血清，经56℃、30分钟灭活处理后，置-20℃冰箱保存备用。空白兔血清：用生理盐水灌胃10日，血清取法同上。
1.2 人胃癌细胞培养：人细胞细胞株(HS-746T)，由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；二苯酰胺Hoechst 33258、硫柳汞thsmerso1购自美国Sigma公司；PI染色剂购自美国BD公司；S-P免疫组化试剂(含Bcl-2单抗、Bax多抗、P16多抗、DAB酶底物显色剂盒等)购自福建迈新公司。电镜标本由广州军区武汉总医院电镜室协助制作。将传代的人胃癌细胞接种于100u/ml青霉素、100μg／ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中(简称单纯培养液，下同)，置5%CO2、37℃培养箱中培养至对数生长期，再分别按实验要求接种。
1.3 荧光染色细胞制备：将人胃癌细胞接种(调整细胞浓度为2×104/ml)于直径为5cm培养皿中，置培养箱培养24小时至细胞生长旺盛，去原培养液，分别加入5%、10%，含药血清浓度的培养液，另设无含药兔血清和单纯培养液组作对照，置培养箱中按细胞常规培养方法培养24小时，去含药血清培养液，加入单纯培养液(此方法下同)，分别培养24小时、36小时、48小时。将上清液收集，培养皿中加胰酶消化，二者合并，离心，去上清；加入含甲醇、冰乙酸的固定液固定，反复2次；离心，去固定液，取细胞沉淀液玻片滴片，置室温下干燥。加入二苯酰胺、硫柳汞荧光染色液染色1小时(避光)。三蒸水反复冲洗3次，常温下自然干燥，甘油封片，Olympus荧光显微镜下(10×20倍)作细胞凋亡的形态学观察。
1.4 透射电镜观察凋亡细胞标本制备：用培养皿接种细胞(细胞浓度2×105/ml)，含药血清浓度和培养方法同1.3。加单纯培养液培养36小时刮片收集细胞，分别离心，去上清，用2.5%的戊二醛液固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon812浸泡、包埋、聚合，超薄切片，硝酸铀、柠檬酸铅染色、晾干，透射电镜下作凋亡细胞的超微结构观察。
1.5 流式细胞仪检测标本制备：用培养瓶接种细胞(细胞浓度2×105/ml)，含药血清浓度和培养方法同1.3。将分别培养24小时、36小时、48小时的细胞上清收集，用胰酶消化培养瓶中的贴壁细胞，将上清和胰酶消化的细胞合并，离心、去上清，沉淀物用PBS洗3次，在震荡状态下缓慢滴入75%乙醇2ml左右，过夜，再用PBS冲洗1次，调至终浓度为1ml，加入0.01%RNA酶15μl，37℃水浴30分钟，加0.25%PI染色(避光)30分钟,作流式细胞仪检测。汞激发波长488nm，分析软件为Modfit。
1.6 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳：在培养瓶中接种细胞(细胞浓度2×106/ml),含药血清浓度和培养方法同1.3。将细胞培养36小时，收集上清，用胰酶消化瓶中贴壁细胞；将二者合并，离心，去上清；按文献［1］方法提取DNA，真空抽干后，溶于60μlTE，缓冲液中加入5μlRNase，反复颠倒混匀，37℃水浴30分钟，取所制备的样品在含溴化乙啶1.5%琼脂糖凝胶中电泳2小时(电压1.5V/cm)，用ethidium bromide染色，紫外线检测仪下观察，摄影。
1.7 Bcl-2、Bax、P16基因表达标本制备：在直径为5cm培养皿中放置3小块消毒的盖玻片，再将人胃癌细胞接种于培养皿中(细胞浓度2×10/ml)，含药血清浓度和培养方法同1.3。分别将培养12小时、24小时、36小时细胞贴壁生长的玻片取出，每张玻片分别用PBS洗2次，滴入4%多聚甲醛液，4℃温度下固定30分钟，室温下干燥，PBS洗3次，按文献［2，3］S-P免疫组化法染色制备标本，在光学显微镜下观察显色效果，显色完后自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固，摄影。
2 结果
2.1 含药血清诱导的凋亡细胞形态学观察
2.1.1 荧光显微镜观察：镜下见不同浓度含药血清孵育24小时、36小时、48小时的人胃癌细胞均有部分细胞核碎裂，呈大小不等、形态不规则的碎片状或梅花状。此即为细胞凋亡的形态，其中以5%含药血清浓度孵育36小时的细胞在镜下显现的凋亡细胞数较多，单纯培养液培养和空白兔血清培养的人胃癌细胞的细胞核圆而完整，未见有凋亡细胞的形态特征(图略)。
2.1.2 透射电镜的超微结构观察：在7000～15000倍的镜下观察可见凋亡细胞的核染色质浓聚成颗粒状或条索状，聚集在核膜下，内质网扩张，出现空泡，有典型的凋亡小体形成(图略)。
2.2 凋亡细胞的流式细胞仪检测：不同含药血清浓度处理36小时、48小时的人胃癌细胞在DNA直方图上的G1期峰前均显现明显的细胞凋亡峰，其中5%36小时组细胞凋亡率为37.02%，10%36小时组为27.20%，5%48小时组为26.7%，10%48小时组为28.11%；单纯培养液培养36小时组和5%、10%24小时未见明显凋亡峰(图略)。5%含药血清孵育24小时的人胃癌细胞，在G1期细胞为12.49%，S期细胞34.30%，G2期细胞53.30%；而单纯培养液组G1期、S期、G2期细胞分别为46.68%、28.10%、25.22%。可见含药血清组G1期细胞数明显减少，S期～G2期细胞数逐渐增多，大部分细胞阻滞在S～G2期。
2.3 DNA凝胶电泳：从图中可见5%、10%含药血清浓度孵育36小时组均有明显的典型DNA梯形条带形成，5%组DNA梯带长度明显长于10%组；单纯培养液组DNA电泳未见梯形条带形成(图略)。
2.4 Bcl-2、Bax、P16基因表达：显色结果示，Bcl-2在单纯培养液组呈高表达(显色深)，在含药血清组呈低表达(显色淡)，而Bax、P16基因在含药血清处理12小时、24小时呈高表达(显色深)，以10%24小时组显色最明显，在36小时组表达稍弱，单纯培养液组亦呈低表达,显色淡(图略)。
3 讨论
1984年，日本学者提出了给动物灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验的药理学新方法。1988年，田代真一正式提出了“中药血清药理学”这一新概念［4］，使中药的药理学实验能较客观地反映药物进入机体后，经过消化、吸收、代谢等而发挥药物效应的过程，排除了传统的中药粗提取物在体外实验中各种干扰因素的影响，能较为清楚地认识中药药理实验中发挥作用的主要有效成分及活性部位，也为中医药研究与现代分子生物学等现代科学技术的结合奠定了可行的基础，提高了中药体外实验的可信性、可靠性。本实验采用血清药理学的研究方法，观察中药复方香龙散诱导人胃癌细胞的凋亡及其对凋亡相关基因表达的影响，从形态学、生化特征、流式细胞术、免疫组化等方面得到验证，表明了香龙散诱导人胃癌细胞凋亡作用的真实性。
香龙散是基于中医对胃癌病症病机为脾虚,痰瘀浊气凝结中焦的认识，选用具有健脾化痰、理气散结等作用的白术、半夏、天龙、九香虫等组方而成。方中半夏、天龙虽有抗肿瘤作用［5］，但对其作用机理尚无深入研究。本实验中发现，由半夏、天龙等组方的香龙散具有诱导人胃癌细胞凋亡作用，并影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P16的表达，这可能与其抗肿瘤的作用密切相关。本实验中发现，香龙散含药血清诱导的人胃癌细胞凋亡，主要是作用于人胃癌细胞的DNA复制期，即大部分细胞阻滞于S期～G2期，抑制了癌细胞的分裂增殖。同时还发现香龙散含药血清对人胃癌细胞诱导的凋亡并非是直接而持续的作用，用5%的含药血清处理24小时后再更换单纯培养液培养36小时，细胞凋亡形态特征更为明显，提示香龙散含药血清诱导的人胃癌细胞凋亡与药物浓度和药物作用时间呈非正比关系,这对临床应用香龙散是一个有益的启发,也表明香龙散含药血清诱导的人胃癌细胞凋亡并非是单一的药物直接作用，可能还与中药诱导其它因子的参与有关。
肿瘤发生、发展的根本原因是基因的改变，表现为许多基因的丢失、失活、突变或过度表达等。如Bcl-2 基因家族是细胞凋亡的关键性调节者［6］，Bcl-2 基因高表达，可提高细胞凋亡的阀值， 抑制细胞的凋亡，并可产生治疗抗性，而Bax 的高表达则可促进细胞凋亡。本研究结果表明， 香龙散含药血清作用于人胃癌细胞， 可使 Bcl-2 表达下降而使Bax、P16基因表达增强。我们推测这是中药香龙散抗肿瘤的作用机理之一。 本实验研究为中药治疗肿瘤研究提供了新的思路和方法。
基金项目：湖北省教委科研基金(1993031)
参考文献
1 姜泊，张亚力，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996:174.
2 施作榕.链霉菌素合物素蛋白-生物毒酶标免疫组化染色法的初步研究.中华免疫学杂志，1986，2(3)：169-170.
3 任占平.应用S-P免疫组化染色法的体会.诊断病理学杂志,1994，1(3)：176-178.
4 田代真一.“血清药理学”と“血清药化学”-汉方の药理学か始まつた药物血中浓度测定の新しぃ世界.TDM研究.1998，(5)：54.
5 杨仓良，程方，高渌纹，等.剧毒中药古今用.北京：中国医药科技出版社，1991:191-202.
6 曾耀英.细胞凋亡分子机制的研究进展.中国科学基金，1999，(3)：137-139.
收稿日期：1999-09-15
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