RT-PCR检测胃癌腹腔液中癌细胞CEA mRNA的表达预测腹膜微转移的研究

中国肿瘤临床 2000年第7期第27卷 论著

作者：王剑锋　徐惠绵　吴涛

单位：王剑锋(抚顺市矿务局总医院普外科　辽宁省抚顺市　113080)；徐惠绵(中国医科大学第一临床学院肿瘤科)；吴涛(抚顺市矿务局总医院普外科　辽宁省抚顺市　113080)

关键词：RT-PCR；CEA；胃癌腹膜转移；腹腔冲洗细胞

　　摘要　目的：探讨RT-PCR方法检测腹腔冲洗液中游离细胞的CEA mRNA表达,对预测胃癌腹膜亚临床转移的意义。方法：收集43例胃癌和7例胃良性病变患者的术中腹腔冲洗液，用RT-PCR方法测定冲洗液中游离细胞的CEA mRNA表达,同时作冲洗液细胞学检查（PLC）。结果：腹腔冲洗液游离细胞的CEA mRNA的表达量随病期的进展、浸润深度的加深而逐渐升高（P＜0.01）；因胃浆膜类型和大体类型的不同其阳性级别亦存在明显差异（P＜0.01）。结论：CEA rT-PCR方法对于检测腹腔微量游离癌细胞较PLC有更高的灵敏度和特异性,是一种检测胃癌腹膜微转移的较好方法。

Detection of CEA mRNA expression in Cancer Cells from Peritoneal Irrigation Fluid by RT-PCR in Gastric cancer Patients Predicting the Micrometastases to Peritoneum

Wang Jianfeng　Xu Huimian　Wu tao(Department of Oncology,First Clinical Hospital,Chinese Medical university,Shenyang)

　　Abstract　Objective:To study the expression mRNA of CEA in free cells from peritoneal irrigation fluid in gastric cancer patients and its significance for predicting the subclinical peritoneal metastases.Methods:The mRNA of CEA expression in free cells from intraperitoneal irrigation fluid in 43 cases of gastric cancer and 7 cases of benign gastric disease were determined by RT-PCR method,and the cytological changes of the irrigation fluid was examined.Results:Twenty-four of 43 gastric cancer patients including 14 patients with positive cytological results were proved positive for CEA mRNA.None of 7 patients with benign gastric disease was positive.Moreover,the value of CEA mRNA expression escalated with the progression of the disease and depth of invasion (p＜0.01).Conclusion:mRNA of cEA is more sensitive and specific than cytologic examination for detecting scanty cancer cells in peritoneal cavity.Therefore,it is a better method in detecting peritoneal micrometastases in gastric cancer patients.

　　Key Words　RT-PCR　Gastric cancer　Peritoneal wash　Cytology　CEA

　　近年来,由于检测手段的不断完善,对于胃癌的早期诊断已有了长足的进步,但对于那些已侵及浆膜的胃癌患者,术后易发生腹膜转移,5年生存率低于35%^［1］。如何正确地筛检腹膜复发高危病例并予以有效的治疗是提高进展期胃癌手术效果的关键问题之一^［2］。已有研究表明,细胞学检查的阳性结果与低生存率之间有明显的统计学意义^［3］，但传统的细胞学检查方法，缺乏一定的灵敏度，一些阴性结果的患者，术后仍有腹膜复发。

　　目前，RT-PCR即反转录聚合酶链式反应，已被广泛地应用于检查外周血、淋巴结、骨等微转移病灶^［4，5］，显示了较高的灵敏度和特异性。本实验采用RT-PCR方法检测在常规细胞学检查中可能被遗漏的游离癌细胞，以期获得一种检测胃癌腹膜微转移更为灵敏的方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1．1.1　研究对象　本实验收集1998年3月～1998年8月间中国医科大学第一临床医院肿瘤外科的胃癌手术患者43例，胃良性病变7例。依据术中所见及术后病理分期，浆膜类型，病理类型分组。同时，用人胃癌细胞系MNK74和HSC39作为阳性对照。

　　1．1.2　试剂　总RNA提取试剂盒，Trizol.Reagent(GIBCO公司)，RT-PCR试剂盒,TiTan one tube RT-PCR SYS(B.M公司) ，OligoDT（10）（B.M公司)， dNTP(B.M公司)。

　　1.2　实验方法

　　1.2．1　标本采集　手术开腹后，于Douglas窝或左膈下置入一根导尿管，注入无菌生理盐水50ml，轻轻搅动后吸出。若有自然腹水的病例则直接吸出。吸取后将冲洗液或腹水于0℃下用2000转离心20分钟。取少许沉渣做涂片，HE染色后，行细胞学检查，其余沉渣于-80℃下保存。

　　1.2．2　RT-PCR检测　总RNA提取：将标本内加入Trizol试剂，按Trizol说明书所示步骤进行RNA提取，得到总RNA。

　　RT-PCR检测：CEA巢式PCR特殊引物序列为：A(outersense):5'-TCTGGAACTTCTCCTG

　　gTCTCTCAGCTGG-3'，B(antisense):5'-TGTA

　　gCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3'，C(innersense):5'-GGGCCACTGTCGGCATCATG

　　aTTGG-3'^［6］。在反应系统中加入OligoDT(10)0.4mmol/L，置于50℃下孵育30分钟,将mRNA反转录成cDNA。再加入引物A和B，加温到94℃变性30秒，45～65℃下退火30秒，再升温到68℃延伸5分20秒，共扩增20个循环。离心后将产物置于另一个PCR管内，再加引物B和C，以同样步骤扩增20个循环。取出产物5μl，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙腚染色，将凝胶置于UVP系统内扫描，呈现131bp条带的即为阳性。用GRABIT2.0电脑软件分析。

　　应用上述方法，首先对胃癌细胞系进行扩增，以获得阳性结果的最小细胞数量级。再以细胞系所提取的总RNA50ng为模板进行扩增，所得的条带作为标准阳性对照100%，实验标本皆以同样数量的总RNA为模板，在相同条件下进行扩增，所得的条带与阳性标准比较，确定相对阳性级别。0为阴性，25%以下为+，25%～50%之间为++，50%～75%之间为+++，75%～100%之间为++++。

　　1.3　统计学方法

　　病期，浆膜类型，浸润深度及病理分型等因素比较用Redit分析和χ²检验。RT-PCR与PLC比较用χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　不同病期中CEA mRNA和PLC阳性率的比较

　　在15例早中期病例中，有1例CEA mRNA结果阳性，PLC均为阴性；而在晚期两组中，CEA mRNA阳性率均明显高于PLC，见表1。

表1　不同病期中CEA mRNA和PLC阳性率的比较　例(%)

　　早中期：m-mp癌　晚期1组：ss-si癌无大体腹膜转移组　晚期2组：ss-si癌　有大体腹膜转移组

　　2.2　CEA mRNA阳性级别与胃癌病理因素对比分析

　　本组以扩增细胞系所得条带作阳性对照，将实验标本扩增所得的阳性条带与之相比作半定量分级，并与病理因素比较。结果表明，随病期进展，浸润深度增加，R值95%可信区间递增，差异显著（P＜0.01）；因大体类型和浆膜型不同，R值95%可信区间亦有明显差异（P＜0.01），见表2。

表2　CEA cDNA阳性级别与胃癌病理因素Redit分析

　　- + ++ +++ ++++:CEA cDNA阳性级别　　*：P＜0.013　讨论

　　近年来，虽然胃癌的外科手术治疗有了长足的进步，但手术仍然不能解决浆膜受侵胃癌术后腹膜复发的问题。PLC(+)与PLC(-)两组之间生存率差别明显，绝大部分PLC(+)患者术后3年死于腹膜复发。许多术中直视下貌似完整的浆膜，实际上已被各种水解酶溶解，癌细胞裸露并脱落入腹腔。据报道，中晚期胃癌的腹腔游离细胞阳性率为43.2%^［7］，本实验浆膜受侵但无大体腹膜转移病例的PLC(+)率达44.1%，而在大体腹膜转移病例中，PLC(+)率仅达到60.0%，说明PLC方法的灵敏度不高，尚存在假阳性问题。

　　近年来，RT-PCR方法已被用于检测微量癌细胞中的特殊mRNA，如淋巴结、肝脏和血液癌细胞的微转移检测，显示了较高的灵敏性^［8］。本实验采用该方法检测腹腔冲洗液的游离细胞，因为腹膜间皮细胞不表达CEA，所以选择CEA的mRNA作为标志，从而明确地区分开间皮细胞和肿瘤细胞。但值得注意的是，腹腔液中白细胞可以表达CEA相关基因，因此在进行PCR扩增的时候，应将退火温度控制在65℃以下，以避免由于白细胞表达CEA所造成的假阳性^［9］。本实验以细胞系为标本作为阳性对照，获得阳性结果的最低细胞数量级为10³，说明RT-PCR实验可以检测很微量的癌细胞。

　　28例进展期无大体腹膜转移病例中（mp癌10例、ss癌以上18例），RT-PCR阳性率为53.6%，说明CEA rT-PCR实验对于检测肉眼不能识别的腹膜微转移具有很大的潜力，而在有大体腹膜转移的病例中，CEA rT-PCR阳性率达90%，说明该实验具有较高的灵敏度。7例胃良性病变的腹腔冲洗液中未见CEA mRNA表达，显示了较高的特异性。因此，RT-PCR作为检测腹膜微转移的筛检方法是比较适宜的。

　　进一步分析，在14例PLC阳性的病例中，CEA mRNA表达亦为阳性；PLC为阴性的19例中，仍有10例CEA mRNA表达阳性，表明RT-PCR方法对检测腹腔液中微量癌细胞的灵敏度优于PLC（P＜0.01)。

　　15例早中期病例中，1例CEA RT-PCR检测为阳性。此例为mp癌，反应型浆膜，淋巴转移阳性。分析癌细胞非浆膜脱落，可能经转移淋巴结被膜脱落所致。1例有明显大体腹膜转移病例，但CEA mRNA为阴性结果，分析可能是由于在标本采集或实验过程中,RNA酶的污染造成了RNA的降解，导致阴性结果。因此，在整个实验过程中应严格控制RNA酶的污染，在反应体系中加入RNA酶抑制剂，防止RNA的降解。

　　本文课题受卫生直属机构重点项目资助

　　参考文献

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1999-09-23