CD基因联合mIL-2/mGM-CSF基因治疗胃癌的研究
中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第3期第7卷 论著
作者：郭善禹 顾琴龙 刘炳亚 朱正纲 尹浩然 林言箴
单位：郭善禹（上海第二医科大学附属第九人民医院外科 上海 200011）；顾琴龙 刘炳亚 朱正纲 尹浩然 林言箴（上海第二医科大学附属瑞金医院外科 200025）
关键词：胃癌；自杀基因；细胞因子；逆转录病毒；RT-PCR
摘 要 目的： 观察CD基因联合mIL-2/mGM-CSF基因对小鼠胃癌的治疗作用。方法： CD基因构建于逆转录病毒载体pLxSN，mIL-2和mGM-CSF基因构建于pIRES。先用CD/5-FC治疗胃癌细胞株，然后联合mIL-2/mGM-CSF两种细胞因子基因治疗小鼠模型胃癌，以期产生显著的抗肿瘤作用。RT-PCR检测基因表达。结果： 体外结果显示20%的转基因细胞即可杀灭70%～80%的肿瘤细胞。动物实验结果表明，应用CD/5-Fc，即可产生很强的抗肿瘤作用。结合mIL-2/mGM-CSF两种细胞因子基因，抗肿瘤作用会得到进一步强化，肿瘤消退速度明显加快，大部分肿瘤完全消退。RT-PCR结果显示，CD基因和mIL-2，mGM-CSF基因均能在组织中表达。结论： CD/5-Fc能够杀灭肿瘤细胞，具有显著抗肿瘤作用。联合IL-2/GM-CSF后，抗肿瘤作用会得到进一步强化，产生明显的抗肿瘤效应。应用病毒和脂质体方法转染自杀基因和细胞因子基因，可以在组织中满意表达。
《中国图书资料分类法》分类号 R735.2； R730.54
Combined Therapy of CD Gene and mIL-2/mGM-CSF Genes for Gastric Cancer
Guo Shanyu, Gu Qinlong, Liu Bingya, Zhu Zhenggang, Yin Haoran, Lin Yanzhen
(Department of Surgery, Shanghai No.9 People′s Hospital, Shanghai 200011)
Abstract Objective: We combined the CD gene and mIL-2/mGM-CSF genes to treat murine gastric cancer, the aim is to produce marked anti-tumor effect.Methods: CD gene was constructed into the retroviral vector pLxSN, the mIL-2 and mGM-CSF genes were inserted into the eukaryotic expressing vector pIRES. In vitro, the murine gastric cancer cells were transfected with retroviral serum and treated with 5-FC; In vivo, the murine model gastric cancer tumor were transfected with retroviral serum, while the mixtures of cytokine plasmid and liposome were injected into the tumor-surrounding tissue, 5-FC was injected into peritoneal cavity.Results: In vitro experiment, 20% of the transduced cells could give rise to 70%～80% of the total cells to death. In vivo results showed that no treatment effect was found in control group. CD/5-FC could inhibit the tumor growth. The strongest anti-tumor effect was shown in the CD/5-FC+mIL-2+mGM-CSF group. The pathologic examination showed necrosis in the treated groups. With the RT-PCR, we examined the expression of interest genes on the mRNA level. The suicide gene and cytokine gene were all expressed in the tissues.Conclusion: CD/5-FC can kill tumor cells in vitro and inhibit the tumor growth in vivo. IL-2 and GM-CSF could strongly enhance the anti-tumor effect. Through the retrovirus and liposome methods, the suicide gene and cytokine genes were all expressed in the tissues.
Key words gastric cancer; suicide gene; cytokine; retrovirus; RT-PCR
胃癌是威胁人类最常见的恶性肿瘤之一，目前的治疗方法主要是手术和化疗，但对中晚期胃癌的疗效却欠理想。基因治疗为胃癌等恶性肿瘤的治疗开辟了新的途径。“自杀基因”即为目前研究较多的肿瘤治疗基因之一。这类基因主要包括大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因(cytosine deaminase-E. coli, CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplx virus-thymidine kinase, HSV-TK)等。它们的作用机理是将本来对哺乳动物细胞无毒性的药物（称为前药）转化为有毒性的药物导致转基因细胞的死亡［1，2］。此外，细胞因子在抗肿瘤免疫中也发挥重要作用。IL-2能激活NK，LAK细胞和CD8+T淋巴细胞，对肿瘤细胞产生直接杀伤作用［3］；GM-CSF在肿瘤免疫中能促进巨噬细胞等抗原提呈细胞对肿瘤抗原的提呈作用［4］。
我们将CD基因联合mIL-2和mGM-CSF两种细胞因子基因治疗小鼠胃癌，以期产生显著的抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 表达载体的构建
CD基因1.2 kb通过酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ构建于逆转录病毒载体pLxSN；mIL-2 (530 bp)和mGM-CSF(450 bp)通过RT-PCR方法从小鼠脾脏中获得，并经测序鉴定正确，它们通过酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ构建于真核表达载体pIRES。
1.2 细胞株和细胞培养
MFC细胞为615小鼠前胃胃癌细胞，培养基为DMEM，含10%小牛血清，置37℃培养箱培养。PA317细胞为包装细胞，在DMEM培养液中生长良好。NIH3T3用作病毒滴度的测定。
1.3 逆转录病毒质粒转染包装细胞并收集上清和测定滴度
1.3.1 应用脂质体方法转染逆转录病毒质粒转染PA317细胞，48 h后更换含 G418的完全DMEM， G418 600 μg/ml，每3 d更换1次；2周后大部分细胞死亡，只剩下少数转染阳性细胞。克隆扩增并收集上清，用3T3细胞测定滴度。
1.3.2 带报告基因阳性克隆的筛选
将报告基因LacZ构建于逆转录病毒载体pLxSN，按同上方法转染包装细胞，用X-gal染色。
1.4 重组逆转录病毒上清感染MFC胃癌细胞株
取最高滴度病毒液感染MFC细胞， G418 筛选，最后剩下感染病毒的细胞，并形成克隆。
1.5 体外试验
1.5.1 药物敏感性检测
将转基因MFC细胞按1×104/孔接种96孔板,并以不同浓度分别加入前药5-FC，连用7 d后，观察细胞存活情况，并用MTT法测定存活细胞比率。酶标仪测定OD490值：
1.5.2 体外旁观者效应检测
将转基因的MFC细胞与未转基因的MFC细胞分别按不同的比例混合，接种于96孔板(1×104/well)，第2天开始应用前药5-FC(500 μg /ml)，连用7 d。观察细胞存活情况，并用MTT法测定存活细胞比率。
1.6 体内试验
1.6.1 动物分组和模型制备
40只615小鼠全部为雌性，6～8周龄，应用皮下注射法建立MFC细胞胃癌模型，然后随机分为4组：①对照组：10只，瘤体内注射生理盐水，不用病毒上清，经腹腔注射5-FC。②CD/5-FC组：10只，瘤体内应用病毒上清，经腹腔应用5-FC。③ CD/5-FC+mIL-2组：10只，应用CD/5-FC的同时，联合应用mIL-2。④ CD/5-FC+mIL-2+mGM-CSF组：10只，应用CD/5-FC的同时，联合应用mIL-2和mGM-CSF。
1.6.2 转染病毒上清和细胞因子基因
分别向瘤内注射病毒上清（含有20 μg/ml polypene）100 μl/次，每周2次，连续2周。对照组向瘤体内注射生理盐水。细胞因子质粒通过阳离子脂质体转导(按说明)。
1.6.3 应用前药和测定肿瘤大小
转染病毒上清3 d后开始向腹腔内注射前药， 5-Fc用量为500 mg*kg-1*d-1，连用3周。每5 d测定肿瘤大小，取最大径和最小径，肿瘤体积1/2 AB2。
1.6.4 体内转基因表达检测
切取部分转基因组织用Trizol试剂抽提RNA，进行RT-PCR反应。
CD基因的引物序列：上游序列：5′-GTGAATT CAGGCTAGCAATGTCGAATAACGCT-3′; 下游序列：5′-GTGGATCCTCAACGTTTGTAATCGATGGCTTC-3′; mβ-actin基因的引物序列为：上游序列：5′-TGACGGGGTCACCCACAC-3′; 下游序列：5′-CTAGAAGCACTTGCGGTG CACG-3′。
CD基因的PCR反应条件为： 95℃变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延长3 min，重复循环39次，72℃延长7 min。
β-actin基因的PCR反应条件为：95℃变性5 min，95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延长1 min，重复循环39次，72℃延长7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
mIL-2上游引物：5′-TCGAATTCTGTACAGCATGCAGC TC-3′,下游引物：5′-TGGATCCGGTACATAGTTATTGAGG GC-3′; mGM-CSF上游引物：5′-CGGAATTCATGTGGCT GCAGAAT-3′, 下游引物：5′-CGGAATTCTTCAGAGCTGG CCTG-3′。
反应条件均为：95℃变性5 min 95℃变性1 min,55℃ 退火50 s,72℃延长1 min,重复30个循环;72℃ 延长8 min。产物行琼脂糖凝胶电泳。
1.7 统计分析
将肿瘤体积测定结果进行方差分析。
2 结 果
2.1 转染质粒
应用脂质体方法将质粒转染包装细胞，应用G418 600 μg/ml 5～7 d，即开始有大量细胞死亡，2～3周后开始有少量贴壁细胞向外生长，与大量死亡细胞形成对比，而且逐渐形成克隆转LacZ基因X-gal染色呈蓝色。
2.2 收集上清
克隆扩增后收集上清，经4℃离心和0.22 μm滤纸过滤后即可用于测定滴度。测定结果表明，病毒滴度最高为2×105 cfu/ml。
2.3 MFC细胞感染结果
病毒上清感染MFC细胞后，第5天开始有大量细胞死亡，3周后开始有少量贴壁细胞生长，4周后这些细胞逐渐形成克隆。
2.4 转基因细胞的体外药物敏感性和旁观者效应
2.4.1 体外药物敏感性
转基因细胞应用前药后，从第2天开始就有细胞死亡，至第7天药物浓度最高的细胞几乎全部死亡，而对照组未转基因细胞未见明显的细胞死亡。
2.4.2 体外旁观者效应
转CD基因的MFC细胞表现出明显的旁观者效应。应用5-Fc 7 d后，完全转基因的细胞已基本死亡，20%的转CD基因细胞也会引起70%～80%的细胞死亡（图1）。
图1 不同比率转CD基因MFC细胞的旁观者效应比较
Fig. 1 Comparison of the bystander effects in the different
percentage of MFC Cells transfected with CD gene
2.5 动物试验
对照组中由于没有转导病毒上清，所以应用前药5-Fc后，没有治疗作用。转导CD基因动物，应用前药后，肿瘤生长受到抑制，同对照组相比，P＜0.01。自杀基因联合细胞因子基因mIL-2后抑制作用明显增强，与单用CD/5-Fc组相比，P＜0.05。联合两种细胞因子mIL-2/mGM-CSF后，抑瘤作用进一步加强，5只动物肿瘤完全消退，与CD联合mIL-2组相比，P＜0.05（图2）。2.6 体内转基因检测
经过RT-PCR反应，体内转染病毒上清和转导细胞因子质粒均能表达目的基因、CD基因(lane 1)，mIL-2(lane 4)和mGM-CSF(lane 6)基因（见图3）。
图2 各组肿瘤体积变化比较
Fig. 2 Comparision of tumor volumes of every groups
图3 RT-PCR结果
Fig. 3 The result of RT-PCR
3 讨 论
自杀基因的作用机理是通过酶/前药系统而起作用，CD基因作用的前药为5-氟胞嘧啶(5-Fc)，它被CD转化为5-Fu导致转基因细胞死亡。但“自杀基因”抗肿瘤更重要的作用是通过产生“旁观者效应”（bystander effect）［2］。由CD基因产生的旁观者效应，使得其杀伤作用能增强数倍。
体外实验表明,20%的转基因细胞即可引起70%～80%的细胞死亡，足见其重要性。
有关自杀基因旁观者效应的机理尚未定论，目前提出的可能机制主要包括: ①缝隙连结，自杀基因催化产生的有毒物质通过缝隙连结传至未转基因的细胞。②凋亡机制，转基因细胞死亡后产生的凋亡小体被周围细胞吞噬，引起细胞死亡。③免疫机制，转基因细胞死亡后产生的抗原被抗原提呈细胞处理后，激活抗肿瘤免疫［5，6］。
有研究表明，CD基因引起的旁观者效应不是通过缝隙连结，转化来的5-Fu可以自由通过细胞膜进入周围细胞，从而起到杀伤作用［7］。
Chen等报道细胞因子IL-2与自杀基因有协同作用，诱导产生全身性肿瘤免疫，导致局部肿瘤消退和抵抗远处部位的亲代细胞接种，抗肿瘤免疫有助于IL-2诱导的CD8+ CTL的激活和增殖［8］。自杀基因引起肿瘤细胞死亡后，释出的肿瘤源性肽类被APC摄取，然后激活CTL细胞，而局部GM-CSF的表达能增强这种抗原递呈功能［9,10］。
实验结果表明，CD/5-Fc能够杀灭肿瘤细胞，具有显著抗肿瘤作用。联合IL-2/GM-CSF后，由于CD基因导致的肿瘤细胞死亡能够刺激免疫反应，而细胞因子又通过激活免疫功能增强自杀基因的旁观者效应。两种作用相辅相成，产生明显的抗自杀肿瘤效应。
本课题受卫生部基金(98-1-312)和上海市自然基金(98B14028)资助.
郭善禹,男,33岁,博士,主治医师,主要从事消化道肿瘤生物学治疗的研究.
参 考 文 献
1，Moolten FC. Drug sensitivity (“suicide”) genes for selective cancer chemotherapy. Cancer Gene Ther, 1994, 1: 279
2，Huber BE, Richards CA, Krenisky TA. Retroviral mediate gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: An innovative approach for cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 8039
3，Freeman SM, Ramesh R, Marogi AJ. Immune system in suicide gene therapy. Lancet, 1997, 349: 2
4，Mahvi DM, Burkholder JK, Turner J, et al. Particle-mediated gene transfer of GM-CSF cDNA to tumor cells: Implications for a clinically relevant tumor vaccine. Hum Gene Ther, 1996; 7:135
5，Freeman SM, Abond CN, Whatenby KA, et al. The “bystander effect”: Tumor regression when a fraction of tumor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993, 53: 5274
6，Denning C, Pitts JD. Bystander effects of different enzyme-prodrug systems for cancer gene therapy depend on different pathways for intercellular transfer of toxic metabolites, a factor that will govern clinical choice of appropriate regimes. Hum Gene Ther, 1997, 8: 1825
7，Mullen CA, Coale MM, Loue R, et al. Tumor expressing the cytosine deaminase suicide gene can be eliminated in vivo with 5-Fc and induce protective immunity to wild type tumor. Cancer Res, 1994, 54: 1503
8，Chen SN, Kosai KL, Xu B, et al. Combination suicide and cytokine gene therapy for hepatic metastasis of colon carcinoma: Sustained antitumor immunity prolongs animal survival. Cancer Res, 1996, 56: 3758
9，Hogge GS, Burkhdder J, Albertini MR, et al. Preclinical development of human GM-CSF transfected melanoma cell vaccine using established canine cell line and normal dogs. Cancer Gene Ther, 1999, 6: 26
10，Shi FS, Weber S, Gan J, et al. GM-CSF secreted by cDNA-transfected tumor cells induces a more potent antitumor response than exogenous GM-CSF. Cancer Gene Ther, 1999, 6: 81
(1999-12-21收稿； 2000-04-13修回)
用户登录 
新用户注册