马豆素抑制胃癌生长及转移的实验研究

中华肿瘤杂志 1998年第3期第0卷 基础研究

作者：刘炳亚　林言箴　尹浩然　陈雪华

单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院外科

　　关键词： 苦马豆素　　胃肿瘤　　肿瘤浸润　　肿瘤转移　　肿瘤种植　　免疫，细胞

　　【摘要】　目的　研究苦马豆素(α-甘露糖苷酶-Ⅱ抑制剂－swainsonine，SW)对宿主的免疫调理作用及其对胃癌生长及转移的抑制作用。方法　给胃癌裸鼠原位种植模型饲养含SW 3 μg/ml饮水,每间隔2天换饲普通饮水2天,8周后处死实验动物，测量肿瘤大小，观察转移情况，测定脾细胞总数、脾细胞及外周血淋巴细胞NK活性。结果　SW组肿瘤体积为0.42±0.26 cm³，明显小于对照组1.60±0.36 cm³,抑瘤率达73.8%(P＜0.01);SW组肝及腹膜转移率(20%、30%)均明显低于对照组(80%、90%),抑制率分别达到75.0%和66.7%(P＜0.01)。饲SW饮水后，裸鼠脾细胞总数明显增加，外周血淋巴细胞NK活性明显升高，脾细胞NK活性亦明显升高。结论　SW有抑制人胃癌在裸鼠体内生长和转移的作用，这一作用可能有免疫反应参与。

　　Inhibition effect of Swainsonine on the growth and metastasis of gastric cancer in vivo　　Liu Bingya, Lin Yanzhen, Yin Haoran, et al. Department of Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

　　【Abstract】　Objective　To study the immunomodulating effect of Swainsonine (SW), an inhibitor of α-mannosidase II, and the inhibiting effect on the growth and metastasis of gastric cancer.Methods　Nude mice with human gastric cancer xenograft orthotopically implanted into the gastric wall were fed with drinking water containing 3 mg/L SW for two days alternating with that containing no SW for two days until sacrificed eight weeks after tumor implantation.Results　The mean tumor volume in the SW-treated group was significantly smaller than that of the control group (0.42±0.26 cm³ vs 1.60±0.36 cm³). Calculated by volume, the tumor growth was inhibited by 73.8%. Metastasis to the liver was observed in 20% and 80% of the SW-treated and control mice, while metastasis to the peritoneum was seen in 30% and 90% of SW-treated and control mice, respectively. The total number of splenic cells, and the NK cell activity both of PBL and splenic cells were all elevated.Conclusion　SW is effective in inhibiting tumor growth and metastasis of human gastric cancer in nude mice. Enhanced immune response, among other things, may be involved in the anti-tumor effect.

　　【Subject words】　Swainsonine　　Stomach neoplasms　　Neoplasm invasiveness　　Neoplasm metastasisNeoplasm seeding　　Immunity, cellular

　　特殊的糖基结构参与细胞-细胞以及细胞-底物之间的反应,作用于诸如淋巴细胞转化、免疫细胞剌激、胚胎化与癌转移等过程。研究表明，β1-6分枝程度与癌肿的疾病进程有关，抑制高尔基体寡糖合成过程还能抑制肿瘤的转移以及实体瘤的生长。

　　苦马豆素(swainsonine, SW)是一种生物碱，起初是在澳大利亚植物swainsona canescens中发现,后来发现在北美植物austragalus、oxytropis和locoweed中也有,另外还可从真菌rhizoctonia leguminicola中分离出来,目前可用多种方法合成。新合成的糖蛋白上N-连接寡糖成熟过程中需要α-甘露苷糖酶II，SW的生物活性在于抑制α-甘露糖苷酶II。体内体外实验表明，SW处理过的MDAY-D2淋巴瘤细胞对内皮细胞粘附性降低,还可抑制肿瘤浸润细胞外基质（ECM）。SW还是一种免疫调理剂，当给鼠口服SW时，可减轻化学药物以及肿瘤引起的免疫抑制,剌激淋巴细胞增殖，增加NK细胞的活性，并可诱导巨噬细胞的肿瘤细胞杀伤活性。我们以原位种植胃癌转移模型为对象，给荷瘤鼠口服SW，观察SW对胃癌生长及转移的抑制作用，和实验鼠脾细胞数及NK细胞活性的变化。

材料与方法

　　1.药物:swainsonine(Sigma),化学结构式为8α, β indolizidine-1α,2α,8β-triol,分子式C₈H₁₅NO₃,分子量为173.2。从locoweed中分离出来,为多种α-甘露苷糖酶抑制剂。

　　2.动物模型:(1)动物：雄性SPF级BALB/c裸小鼠,6～8周龄，体重18～20 g（上海市肿瘤研究所提供）。(2)肿瘤：胃腺癌细胞株SGC－7901,2×10⁶细胞注射于裸鼠皮下，成瘤后反复传代至实体瘤。种植前处死荷瘤鼠，无菌下完整取出肿瘤，放入含青霉素和链霉素的生理盐水中，剪成3 mm大小肿块。(3)原位种植：麻醉裸鼠，皮肤消毒，腹中线切口进腹，暴露胃壁，于腺胃大弯侧切开浆膜，将肿瘤组织块缝合于浆膜切口处。

　　3.治疗试验：肿瘤种植术前1天开始给鼠饮用含SW 3 μg/ml的饮水,每间隔2天饮普通饮水2天,对照组一直以普通饮水饲养。肿瘤种植后8周处死动物,测量肿瘤最大径(a)和最小径(b),处死时取血加肝素抗凝,取脾脏,观察淋巴结、肝、脾、腹膜、肾、肺等转移情况。肿瘤体积(V)=ab²/2，抑瘤率＝(对照组V－治疗组V)/对照组V×100％。

　　4.脾细胞计数:处死动物时完整取下脾脏,立即放于Hank液中研磨,制成单细胞悬液,经100目尼龙网过滤,ficoll不连续梯度离心,收集界面淋巴细胞进行计数。

　　5.NK活性测定:(1)效应细胞的准备:外周血淋巴细胞、脾淋巴细胞以RPMI-1640(Gibco)洗2次,继以含0.5%BSA RPMI-1640洗1次,以RPMI-1640调整细胞浓度到5×10⁹/L。(2)靶细胞的准备:以鼠白血病细胞YAC-1为靶细胞,调整细胞浓度为5×10⁹/L。(3)细胞毒试验:设样品管,自然释放管及最大释放管，每种同时做3只复管。每管中各加入YAC-1 100 μl，样品管加100 μl样品，自然释放管加100 μl RPMI－1640，最大释放管加100 μl 1%NP－40混匀,1 000 r/min离心5分钟，37℃ 5% CO₂培养2小时,再加RPMI-1640 50 μl混匀,1 000 r/min离心5分钟，各管取上清液100 μl于96孔板反应孔中,于32℃预温,每孔加100 μl LDH底物混合液,于酶标比色仪比色(λ=490nm)测出吸光度(A)。

　　细胞毒=(样品管A-自然释放管A)/(最大释放管A-自然释放管A)×100%。

结果

　　1.SW对原位肿瘤生长的抑制作用:种植肿瘤胃壁原位均有生长,呈圆形、椭圆形或不规则形,表面有结节状突起,呈粉红色鱼肉样,实质性。治疗组原位肿瘤平均体积为0.42±0.26 cm³，明显小于对照组1.60±0.36 cm³，抑瘤率为73.8%(表1)。

　　2.SW对胃癌转移的抑制作用：SW治疗组腹膜、肝、脾、肾等转移率受到明显抑制,腹膜转移及肝转移的抑制率分别为66.7%和75.0%，结果见表1。

表1　SW对胃癌生长及转移的抑制作用

　　3.SW对宿主免疫系统的作用：分别测定了饮用SW 3 μg/ml与普通饮水鼠的外周血淋巴细胞及脾细胞的NK活性以及脾细胞总数,结果显示饮用SW鼠外周血淋巴细胞及脾细胞NK活性均较对照组有明显升高,脾细胞总数亦较对照组有显著增加,结果见表2。

表2　SW对鼠免疫系统的影响(±s)

讨论

　　正常成熟细胞由间隔屏障限制,而转移性细胞之所以能摆脱这些束缚转移出去,是由于在粘附、侵袭、移动、免疫决定等方面表现出一定的改变,在这些方面的改变中,细胞表面成分(包括糖蛋白和糖脂)起着重要作用^［1］。SW是α-甘露糖苷酶抑制剂，通过改变细胞表面糖蛋白的糖基结构而起作用。

　　SW可抑制肿瘤生长和转移。我们给荷瘤鼠以3μg/ml SW饮水(约相当900 μg*kg^-1*d^-1剂量)，每间隔2天给药2天,使肿瘤体积抑制了73.8%,腹膜转移抑制了66.7%,肝转移抑制了75.0%。文献报道^［2，3］，不同途径给予SW均可抑制荷瘤鼠的肿瘤克隆形成和实体瘤的生长速度,并可延长移植肿瘤鼠去除原发肿瘤后的生存期。

　　SW的抑瘤作用机理可概括为对肿瘤本身和对宿主两方面作用。对肿瘤的作用有：（1）SW可降低肿瘤细胞对内皮细胞的粘附。存在于肿瘤细胞与内皮细胞的半乳糖结合植物血凝素是血循环中肿瘤细胞在毛细血管滞留的原因。体外实验显示,SW可减少N-连接的寡糖中Galβ1-4GluNAc分枝,可降低MDY-D₂肿瘤细胞与单层内皮细胞的粘附^［4］。（2）SW能抑制肿瘤细胞对ECM的浸润作用。具体是增加金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）基因的转录和抑制IV型胶原酶的表达^［1,5］，而TIMP与基质金属蛋白酶（MMP）之间的平衡是决定肿瘤细胞浸润能力的重要因素^［6］。（3）SW可诱导逆转已具转移表型的肿瘤细胞。在肿瘤细胞演变为浸润转移表型过程中，β1-6GlcNAc分枝的糖蛋白可能很重要。由于大多数生长因子及其受体是糖蛋白,在这些分子中的某些发生癌相关的糖基化改变作用于信号传导通路,从而以此方式启动恶性表型。酪氨酸激酶受体,诸如fms和sea在细胞外区段被糖基化,连续激活突变,这些转化活化取决于糖基化作用^［7］。SW的作用就在于抑制这些糖基化过程。

　　SW的另一作用是剌激机体免疫系统使其活化,而具更强的抗肿瘤能力，尤其是对NK细胞、巨噬细胞、细胞毒T细胞皆起明显的增强作用。用SW处理过的鼠,其NK细胞肿瘤杀伤活性增加2～3倍,脾细胞数明显增加^［8］。SW还可增强ConA剌激人淋巴细胞增殖^［5］,增加T淋巴细胞IL-2R表达和有丝分裂原剌激后IL-2诱导的细胞增殖,以及增加IL-2诱导的LAK活性和HLA-I抗原表达，诱导巨噬细胞的肿瘤杀伤活性^［9］。

　　本实验结果表明,给荷瘤鼠SW 3 μg/ml饮水,外周血NK细胞活性增加了63.6%,脾NK细胞活性增加了150.3%,脾细胞总数增加了89.0%。

参考文献

　　1Seftor REB, Seftor EA, Grimes WJ, et al. Human melanoma cell invasion is inhibited in vitro by swainsonine and deoxymannojirimycin with a concomitant decrease in collgenase IV expression. Melanoma Res, 1991,1:43-54.

　　2Humphries MJ, Olden K. Aspragine-linked oligosaccharides and tumor metastasis. Pharmac Ther, 1989,44:85-105.

　　3Dennis JW, Koch K, Yousefi S, et al. Growth inhibition of human melanoma tumor xenograftes in athymic nude mice by swainsonie. Cancer Res, 1990, 50: 1867-1872.

　　4Coril I, Kerbel RS, Dennis JW. Tumor cell surface β 1-4 linked galactose binds to lectin(s) on microvascular endothelial cells and contributes to organ colonization. J Cell Biol, 1990,111:773-782.

　　5Korczak B, Dennis JW. Inhibition of N-linked oligisaccharide processing in tumor cells is associated with enhanced tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) gene expression. Int J Cancer, 1993,53:634-639.

　　6刘炳亚，王瑞年，尹浩然，等. 肿瘤浸润转移阻断治疗的研究进展. 国外医学肿瘤学分册，1995,22:327-330.

　　7Goss PE, Baker MA, Carver JP, et al. Inhibitors of carbohydrate processing: a new class of anticancer agents. Clin Cancer Res, 1995,1:935-944.

　　8Humphries MJ, Matsumoto K, White SL, et al. Augmentation of murine natural killer cell activity by swainsonine, a new antimetastatic immunomodulator. Cancer Res, 1988,48:1410-1415.

　　9Yagita M, Noda I, Maehara M, et al. The presence of concanavalin-A(CON-A)-link molecules on natural-killer (NK)-sensitive target cells: their possible role in swainsonine-augmented human NK cytotoxity. Int J Cancer, 1992,52:664-672.

(收稿：1997-10-14　　修回：1997-12-09)