VEGF的单抗制备及胃癌细胞MGC803表达VEGF的鉴定

中华肿瘤杂志 1999年第2期第0卷 基础研究

作者：田学军　吴健　孟麟　寿成超　董志伟

单位：100034 北京市肿瘤研究所北京医科大学临床肿瘤学院［田学军、吴健、孟麟、寿成超(联系作者)］；中国医学科学院肿瘤研究所(董志伟)

　　关键词： 胃肿瘤；血管内皮细胞生长因子；抗体，单克隆

　　【摘要】　目的　从胃癌细胞MGC803克隆并在体外表达血管内皮细胞生长因子(VEGF), 利用VEGF₁₂₁单克隆抗体对其产物进行鉴定，为进一步明确肿瘤组织中VEGF来源，并以VEGF为靶点治疗肿瘤奠定基础。方法　用杂交瘤技术制备VEGF₁₂₁单克隆抗体(McAb)，通过ELISA、³H-TdR掺入检测其活性；用RT-PCR从MGC803细胞克隆VEGF基因，与原核表达载体PGEX2T重组, 在大肠杆菌中进行表达，以Western blot 对表达产物进行鉴定。结果　所制备的VEGF McAb能特异性地同VEGF结合，并能中和VEGF对内皮细胞的促增殖作用；利用RT-PCR扩增出特异的VEGF基因片段，重组到PGEX2T表达载体中，在大肠杆菌XL-1blue中得到了稳定高效表达的蛋白产物，并能特异性地被VEGF抗体所识别。结论　在MGC803细胞中存在VEGF mRNA表达，提示肿瘤细胞是肿瘤组织中VEGF的重要来源。VEGF McAb不仅可对其存在进行检测，而且可有效抑制VEGF对内皮细胞的促增殖作用，可望在肿瘤治疗中发挥作用。

　　Preparation of monoclonal antibodies to human vascular endothelial growth factor(VEGF₁₂₁) and identification of its expression on gastric carcinoma cell line MGC803　　TIAN Xuejun, WU Jian, MENG Lin, et al. Department of Biochemistry and Molecular Biology, The School of Oncology, Beijing Medical University, 100034

　　【Abstract】　Objective　To further elucidate the source of VEGF in solid tumors.Methods　Traditional hybridoma technology was used to prepare VEGF monoclonal antibodies (McAb); It's activity was measured by³ H-TdR incorporation on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). VEGF gene was amplified by PCR with cDNA as template from MGC803 cell lines. The PCR products were cloned into fusion protein prokaryotic expression vector PGEX2T which expressed in E.coli XL-1blue. Western blot analysis was used to identify expression of VEGF.Results　The McAbs could specifically bind to VEGF in ELISA. One of the McAbs(5C₅) could neutralize the mitogenic activity of VEGF₁₂₁ on HUVEC in a dose-dependent manner. The VEGF gene fragment obtained from RT-PCR cloned to PGEX2T vector expressed a protein product which reacted specifically with McAb 5C₅.Conclusion　Gastric carcinoma is shown to express VEGF. It may be a major source of VEGF in human solid tumor. Monoclonal antibody against VEGF may be of value in the treatment of cancer.

　　【Subject words】　Stomach neoplasms　　Vascular endothelial growth factor　　Antibodies, monoclonal

　　血管内皮细胞生长因子(VEGF)又称血管通透因子（VPF），是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，可与其两种特异受体KDR和flt-1结合，对内皮细胞的生长有直接的刺激和趋化作用^［1］，在肿瘤的发生、发展和转移中有重要作用。VEGF₁₂₁是4种VEGF中分子量最小的一种，它具有VEGF的全部生物学活性，是分子水平上研究VEGF生物作用较为理想的一种^［2］。我们从MGC803细胞中克隆、表达了VEGF₁₂₁，利用所制备的VEGF₁₂₁单抗对该表达产物进行鉴定，为进一步明确肿瘤组织中VEGF来源提供新的依据。

　　材料与方法

　　1.材料：Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，购自中国医学科学院实验动物中心。内皮细胞系由中国预防医学科学院病毒研究所惠赠。MGC803细胞为从一低分化胃癌患者手术标本所建立的细胞系。活性VEGF₁₂₁纯品由北京医科大学马大龙教授惠赠。³H-TdR购自上海原子能研究所。

　　2. 抗VEGF₁₂₁McAb杂交瘤细胞的制备、筛选及单抗纯化：用纯化后的融合蛋白GST-VEGF₁₂₁(由本室表达获得)按传统杂交瘤制备方法进行制备。通过双筛，选取与GST-VEGF反应阳性而与GST-P21反应阴性的细胞克隆，用有限稀释法进行三次亚克隆，获得的阳性克隆细胞株上清再用有活性的VEGF₁₂₁纯品进行ELISA鉴定，用亚类检测试剂盒(Zymed co.)测定单抗亚类。将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔，制备腹水，用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析纯化抗体。

　　3. McAb的中和活性测定：用³H-TdR掺入进行VEGF抗体的中和活性实验。消化贴壁生长的内皮细胞，调整细胞至2×10⁴/ml，接种24孔培养板，1 ml/孔，继续孵育48小时后撤血清。再培养24小时分组，实验组均加入10 ng/ml VEGF₁₂₁纯品^［2］，以不同浓度加入McAb，继续作用30小时后，加入³H-TdR, 37kBq/孔(1μCi=37 kBq)，再作用6小时中止反应。微孔滤膜(直径0.45 μm)收集细胞，烘干，置液闪瓶内进行液闪计数。

　　4. MGC803细胞及内皮细胞VEGF的RT-PCR扩增： 按RNA提取试剂盒(Gibco BRL公司产品)说明书提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒步骤(Gibco BRL)合成cDNA。取cDNA反应液2 μl，用VEGF₁₂₁的5'-末端引物（5'-GGG GGA TCC GCC TCC GAA ACC ATG AAC TT-3'）及3'-末端引物（5'-CCC GAA TTC TCC TGG TGA GAG ATC TGG TT-3'，设计有BamH I和EcoR I酶切位点)，通过PCR进行VEGF扩增。PCR条件为95℃预变性5分钟，94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟，36个循环后，72℃继续反应5分钟，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。按相同方法扩增内皮细胞中的VEGF₁₂₁。

　　5. GST-VEGF表达载体的构建：用凝胶DNA纯化试剂盒(Qiagen公司产品)，按说明书回收PCR扩增片段，将其克隆到含GST的表达载体PGEX2T（含有相同酶切位点)中，电转化大肠杆菌XL-1bule,扩增培养后提取质粒DNA，酶切后以0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

　　6. VEGF的表达及鉴定：挑选重组阳性菌落，置LB培养液，37℃摇菌过夜，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。按《分子克隆》一书方法进行Western blot分析。

　　结　果

　　1. 抗人VEGF McAb杂交瘤细胞系的建立：GST-VEGF免疫小鼠后进行融合，经融合蛋白GST-VEGF和GST-P21抗原铺板进行双筛及重复亚克隆后，得到6株能稳定分泌VEGF抗体的杂交瘤细胞，用纯品VEGF₁₂₁进行ELISA检测。将其中反应最强的5C₅，接种小鼠腹腔，得到纯化的5C₅McAb，A₂₈₀（吸光度，曾称光密度OD)定量为1 mg/ml，亚类为IgG₂b。

　　2. McAb的活性测定：将5C₅加入VEGF₁₂₁刺激的内皮细胞培养液中，与未加VEGF₁₂₁组相比，可见加入VEGF₁₂₁可以明显刺激内皮细胞的生长。而5C₅从2.5 μg/ml开始，能够中和VEGF₁₂₁的这种促增殖作用，并表现出较好的剂量依赖关系。当5C₅加入量达到10 μg/ml时，其内皮细胞的³H-TdR掺入量与正常未加VEGF₁₂₁组差异无显著性，表明它已完全中和了VEGF₁₂₁的活性（图1)。

　　3. MGC803细胞及内皮细胞中VEGF的RT-PCR扩增：提取细胞总RNA，甲醛变性电泳鉴定RNA 28S与18S条带清晰。逆转录合成cDNA为模板进行PCR扩增。所用PCR引物扩出的VEGF为含有信号肽序列的VEGF₁₂₁，扩增片断全长约为550 bp。由0.8%琼脂糖凝胶电泳可见，MGC803细胞中扩增出约550 bp的特异条带，而内皮细胞中未见特异条带出现（图2)。

　　4. GST-VEGF表达载体的构建及其表达：重组质粒经用EcoR I/BamH I酶切鉴定，含有550 bp的VEGF DNA片段（图2）。将质粒转化大肠杆菌XL-1b1ue后进行原核表达。因PGEX2T表达产物为含GST(26 000)的融合蛋白，重组GST-VEGF表达产物的相对分子量应为40 000左右。上述表达产物经10%SDS-PAGE电泳，可见在40 000左右的位置有稳定表达产物，约占菌体总蛋白的25%，存在于包涵体沉淀中(图3)。

　　5. Western blot对表达产物的鉴定：结果显示，IPTG诱导的重组GST-VEGF表达产物能与5C₅特异结合（图4)，表明该产物确为重组VEGF的表达产物。

　　讨　论

　　抑制肿瘤血管的形成与生长是近年来肿瘤治疗的一个重要方向。血管内皮细胞的增殖、迁移和适合血管生长的基质形成，是血管形成的重要环节。有效的抑制肿瘤组织中VEGF的表达，用其特异抗体中和VEGF的活性，阻止其功能的发挥，是治疗肿瘤的又一有效途径^［3］。本研究用鼠源单抗5C₅在体外可以较好的中和VEGF₁₂₁的活性，从而抑制其功能的发挥，这从另一个角度也证实了该单抗的特异性。

　　对于肿瘤组织中VEGF的来源目前认识不一，Wizigmann等^［4］证明肿瘤组织中的VEGF主要存在于肿瘤细胞，并以旁分泌的方式与肿瘤血管内皮上相应的受体结合，促进血管生长。Plate Hetal等^［5］则发现VEGF可以由肿瘤血管内皮细胞表达，而正常组织中的内皮细胞没有表达。Brown等^［6］认为在正常血管内皮细胞中也有VEGF表达。我们从胃癌细胞系MGC803中经RT-PCR扩增得到了VEGF₁₂₁基因，同时将MGC803的上清加入血管内皮细胞培养液中，也发现其可促进内皮细胞的³H-TdR参入量。这说明在MGC803细胞中存在有VEGF的mRNA表达，而正常内皮细胞中未扩增出相应的VEGF₁₂₁，这与Wizigmann的结果相一致。

　　明确肿瘤组织中VEGF的细胞来源，能够更有针对性的从基因水平上阻断VEGF的表达，从而更有效地抑制肿瘤血管生长。本实验室正应用phage display的方法制备人源化的VEGF 单抗，一方面希望获得人源化的VEGF抗体基因，导入肿瘤细胞达到基因治疗肿瘤的目的；另一方面，人源化抗体的获得，可减少鼠源单抗的异源反应，为临床上VEGF单抗的使用打下基础。目前这方面的工作正在进行中。

　　本课题受国家“九五”、863高技术项目资助（编号86310209）

　　参考文献

　　1　Connolly DT, Heuvelman DM, Nelson R, et al. Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest, 1989, 84:1470-1478.

　　2　Asano M, Yukita A, Matsumoto T, et al. Isolation and characterization of neutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF₁₂₁). Hybridoma, 1995, 14:475-480.

　　3　Kim KJ, Winer J, Armanini M, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature, 1993, 362:841-844.

　　4　Wizigmann VS, Breier G, Risau W, et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von hippellindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res, 1995, 55: 1358-1364.

　　5　Plate HK, Breier G, Weich HA, et al. Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature,1992,359: 845-848.

　　6　Brown LF, Berse B, Jackman RW, et al. Expression of vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993,53:4727-4735.

(收稿：1998-07-01　　修回：1998-08-18)