Bcl-2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

中华肿瘤杂志 1999年第4期第21卷 基础研究

作者：路平　陈峻青

单位：110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院 肿瘤科

　　关键词： 胃肿瘤；细胞凋亡；bcl-2基因；反义寡核苷酸

　　【摘要】　目的　探讨反义寡核苷酸(ASODN)对bcl-2基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法　应用MTT方法比较两条人工合成的ASODN直接作用及其以脂质体(DOTAP)为载体对胃癌细胞的抑制效果。应用流式细胞术和RT-PCR方法检测ASODN对bcl-2蛋白和mRNA表达量的调控。应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术等方法，观察bcl-2 ASODN诱导BGC-823胃癌细胞凋亡的效果。结果　MTT实验显示两条ASODN抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性，且靶位点于mRNA蛋白编码区(ASODN2)和以DOTAP为载体的ASODN对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。ASODN作用于胃癌细胞，降低bcl-2蛋白和mRNA表达。bcl-2 ASODN处理胃癌细胞，观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征性改变。结论　bcl-2 ASODN可降低bcl-2 mRNA和蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡。

Apoptosis of human gastric cancer cells induced by bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides

LU Ping, CHEN Junqing. The First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001

　　【Abstract】Objective　To study the regulation of bcl-2 gene expression and induction of apoptosis by bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODN) on human gastric cancer cell line BGC-823 in vitro.Methods　Two bcl-2 AS-ODNs were synthesized, one covering the initiation sequence of translation of bcl-2 mRNA (AS-ODN1) and the other covering the protein coding region (AS-ODN2). BGC-823 cells in logarithmic phase of growth were cultured in the presence of free or liposome (DOTAP)-encapsulated AS-ODN. Cell growth was assessed by MTT method. The expression of bcl-2 at mRNA and protein levels was examined by RT-PCR and flow cytometry, respectively. Electron microscopy and flow cytometry were used to demonstrate apoptotic changes in AS-ODN-treated cells.Results　Both AS-ODNs inhibited proliferation of BGC-823 cells. The inhibitory activity of AS-ODN2 was stronger than that of AS-ODN1. AS-ODNs encapsulated in liposome led to more marked inhibition of cell growth than free AS-ODNs. Both AS-ODNs reduced bcl-2 expression of BGC-823 cells at mRNA and protein levels. Apoptosis of BGC-823 cells were demonstrated by the appearance of apoptotic bodies, chromatin condensation and pre-G₁ peak on flow cytometric analysis.Conclusion　Antisense oligodeoxynucleotide of bcl-2 decreases bcl-2 gene expression and induces apoptosis of human gastric cancer cells in vitro.

　　【Subject words】　Stomach neoplasms　　Apoptosis　　bcl-2 gene　　Antisense oligodeoxynucleotides

　　bcl-2基因被认为能够特异性的抑制凋亡基因，它能够抑制许多类型细胞的凋亡，以此基因为靶向的研究已成为肿瘤凋亡及基因治疗的热点^［1］，但此研究在胃肠道恶性肿瘤尚属起步阶段。我们人工合成两条于bcl-2 mRNA不同位点互补的反义寡核苷酸(ASODN)，探讨ASODN对bcl-2基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。

材料与方法

　　1.细胞系和细胞培养：人胃癌细胞系BGC-823在含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，95%湿度，5%CO₂的条件下连续培养。人工合成ASODN1为5′-CAGCGTGCGCCATATTTCCC-3′(翻译起始区)，ASODN2为5′-AATCCTCCCCCAGTTCACCC-3′(蛋白编码区)，对照寡核苷酸(bcl-2 cDNA序列)为3′-GTCGCACGCGGTATAAAGGG-5′^［2］。以上寡核苷酸由中国军事医学科学院经DAN合成仪合成，均为硫代磷酸型(即片段中的磷酸二酯键磷上的氧被硫取代)。反义寡核苷酸和对照寡核苷酸以60 μmol/L、30 μmol/L、15 μmol/L浓度加入处于指数增殖期的培养细胞。

　　脂质体(DOTAP，Boehringer Mannheim, Germany)介导的bcl-2 ASODN细胞转染按产品说明书操作。ASODN2和DOTAP的终浓度分别为3 μmol/L和10 μmol/L。细胞抑制实验(MTT法)按常规操作进行^［3］。

　　2.RT-PCR检测bcl-2 mRNA表达：逆转录反应(逆转录试剂盒MBI，USA)：70℃5分钟、37℃60分钟、70℃10分钟至4℃保存。PCR反应：94℃4分钟、92℃40秒、60℃40秒、70℃45秒(30次循环)，75℃延伸5分钟。bcl-2引物序列^［4］为：5′-CTTCAGAGACA-GCCAC-3′，5′-ATGGCGCACGCTGGGAGAAC-3′(635 bp)。内参β-actin引物序列：5′-AAGGAATTCCT-ATGTGGGC-3′，5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′(533 bp)，北京军事医学科学院合成。

　　3.流式细胞术检测bcl-2蛋白表达：875 μl冷PBS加入125 μl 2%多聚甲醛4℃1小时，0.05% Tween 20 37℃15分钟，1∶50倍bcl-2单克隆抗体4℃30分钟，1∶100倍FITC标记的IgG 4℃1小时待测。

　　4.流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰变化：70%冷乙醇4℃固定24小时以上，RNA酶A 37℃30分钟，PI 4℃避光30分钟待测。

　　电镜标本按常规方法制备。

结果

　　一、不同的ASODN对胃癌细胞的抑制作用

　　1.ASODN1、ASODN2对BGC-823细胞的抑制率：随着ASODN浓度的提高和作用时间延长，BGC-823细胞的抑制率增强(P＜0.05～0.01)，与ASODN1比较，ASODN2对BGC-823细胞的抑制率较强，P＜0.05。

　　2.以DOTAP为载体的ASODN转染对BGC823细胞的抑制率：浓度为3 μmol/L的ASODN2以DOTAP为载体转染细胞的细胞抑制率24小时为：11.8±4.5，48，72小时时分别为40.0±2.5和79.0±2.4，与对照组比较，P＜0.01。

　　二、ASODN对bcl-2基因表达影响

　　1.流式细胞术检测ASODN对bcl-2蛋白表达的调控：BGC-823细胞经60 μmol/L、30 μmol/L bcl-2 ASODN或对照寡核苷酸处理，48小时后用流式细胞术检测平均荧光强度。30 μmol/L ASODN组为0.20±0.07，对照寡核苷酸组为0.72±0.12，两组比较，P＜0.05；60 μmol/L ASODN组为0.09±0.09，对照寡核苷酸组为0.80±0.36，两组比较，P＜0.01。

　　2.RT-PCR检测bcl-2 mRNA变化：RT-PCR产物电泳显示，对照和处理组均出现特异性的bcl-2基因条带，ASODN组基因表达明显低于对照寡核苷酸和正常培养细胞组。激光光密度扫描仪扫描后，对照寡核苷酸和正常培养细胞组bcl-2/β-actin比值分别为0.8±0.01、0.7±0.3，两者差异无显著性；而60 μmol/L和30 μmol/L ASODN组分别为0.3±0.02，0.07±0.01，与对照组相比，明显降低(P＜0.01)。

　　　三、ASODN诱导胃癌细胞凋亡的作用

　　1.形态学改变：两条ASODN(60 μmol/L)处理BGC-823胃癌细胞，24小时后，相差显微镜可观察到细胞体积缩小、细胞皱缩、细胞解离成彼此粘附成簇的圆型小体——凋亡小体。扫描电镜可见细胞体积缩小，癌细胞表面微绒毛减少，凋亡小体出现。透射电镜可见癌细胞核染色质聚积于核周，细胞核固缩，电子密度增高。

　　2.流式细胞术检测DNA含量变化：bcl-2 ASODN(60 μmol/L、30 μmol/L)处理48小时后，可见细胞凋亡峰出现，S期、G₂M期细胞百分率下降。

讨论

　　反义核酸体内抗核酸酶降解是其得以应用的关键，我们观察到硫代磷酸修饰的两条ASODN均有良好的肿瘤抑制作用，证实硫代寡核苷酸的物化及生物学性质与寡核苷酸很相似，且具有较强的抗核酸酶能力。DOTAP具有无毒性、无免疫原性的特点，且可明显阻断核酸酶对ASODN的降解^［5］。我们应用3 μmol/L ASODN2以DOTAP为载体处理BGC-823细胞系，有良好的细胞抑制率作用(P＜0.01)，说明DOTAP的应用对提高ASODN的作用是十分有益的。

　　我们观察到封闭不同作用靶位的ASODN(ASODN1封闭bcl-2 mRNA的翻译起始区，ASODN2封闭蛋白编码区)，对BGC-823细胞有不同的抑制率(P＜0.05)。因寡核苷酸碱基含量及结合位点不同，与靶序列的结合能力亦不同，与肿瘤细胞的特异性及个体差异是否有关，有待进一步研究证实。

　　在凋亡的基因调控中，bcl-2为凋亡抑制基因，其调控凋亡的作用是十分重要的。以封闭bcl-2基因表达诱导胃癌细胞凋亡的研究尚未见文献报道^［1］。我们从光镜、电镜、流式细胞术观察到特征性细胞凋亡改变，并观察到bcl-2 ASODN可降低胃癌细胞bcl-2蛋白表达和mRNA表达水平，证实ASODN有封闭bcl-2基因表达，诱导胃癌细胞系凋亡的作用。我们认为，ASODN调控bcl-2基因表达的意义，除了增强或减弱药物等凋亡诱导因素的作用以及对肿瘤细胞增殖的抑制作用外，bcl-2 ASODN有可能成为以凋亡为靶向的独立的抗肿瘤治疗方法，但尚需进一步证实。

　　本课题受辽宁省自然科学基金资助(编号 962308)

　　 参考文献

　　1　Reed JC. Promise and problems of bcl-2 antisense therapy. J Natl Cancer Inst, 1997,89：988-990.

　　2　Ziegler A, Luedke GH, Fabbro D, et al. Induction of apoptosis in small-cell lung cancer cells by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the bcl-2 coding sequence. J Natl Cancer Inst, 1997, 89：1027-1036.

　　3　Green LM, Reade JL, Ware CF, et al. Rapid colormetric assay for cell viability: application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines. J Immunol Methods, 1984, 70：257-268.

　　4　Sato T, Hanada M, Bodrug S, et al. Interaction among members of the bcl-2 protein family analyzed with a yeast two-hybrid system. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91：9238-9242.

　　5　Capaccioli S, Pasquale GD, Mini E, et al. Cationic lipids improve antisense oligonucleotide uptake and prevent degradation in cultured cells and in human serum. Biochem Biophys Res Commun, 1993,197：818-825.

(收稿：1998-12-02　　修回：1999-03-02)