CDKN2基因CpG岛异常甲基化与原发性胃癌的关系研究

肿瘤 1999年第3期第19卷 论　著

作者：全欣鑫 于皆平 邱启裕 王 萍

单位：全欣鑫 于皆平（湖北医科大学附属第一医院(武汉市 430060)；邱启裕（湖北医科大学附属第二医院）；王 萍（黄石市中心医院）

关键词：基因，CDKN2；甲基化；胃肿瘤

　　目的 探讨原发性胃癌中抑癌基因CDKN2的灭活机制。 方法 PCR-甲基化检测法检测36例胃癌和22例正常胃粘膜组织中CDKN2基因外显子1的CpG岛异常甲基化情况。结果 有13例(36.1%)胃癌标本和1例(4.5%)正常胃组织中CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化，两者之间有显著性差异(P＜0.05)。结论 CDKN2基因的5′端CpG岛异常甲基化与胃癌的发生发展相关，是该基因在原发性胃癌中的主要灭活机制。

METHYLATION OF 5′CpG ISLAND IN THE CDKN2 TUMOR SUPP

　　RESSOR GENE IN HUMAN PRIMARY GASTRIC CANCER

Quan Xinxin,Yu Jieping,Qiu Qiyu,et al.

　　The Research Center of Gastroenterology,Hubei Medical University,Wuhan 430060

　　Objective：To study the inactivationmechanism of the CDKN2 gene in human primary gastric cancer.Methods：A PCR-based methylation assays was used to analyze themethylation status of the CDKN2 gene in 36 gastric cancers and 22 normal gastric tissues.Results：Abnormal methylation of the 5′ CpG island of CDKN2 gene was observed in 13 of 36(36.1%)primary gastric cancer cases and in1 of 22(4.5%) normal gastric mucosa,and there is a significant difference(P＜0.05) between them.Conclusion：The results suggest that CDKN2 tumor suppressor genemay be inactivated by methylation of its 5′CPG island in human primary gastriccarcinoma.

　　Key words gene，CDKN2 Methylation Gastric carcinoma

　　抑癌基因CDKN2在人常见肿瘤中有高频率的变异，其失活机制包括突变、缺失、CpG岛异常甲基化和染色体易位等。在消化道肿瘤中现已发现食管鳞癌［1］和结肠癌［2］有CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化现象，但在胃癌中却未见报道。作者在研究了CDKN2基因在原发性胃癌中突变缺失的基础上，进一步研究了胃癌组织中CDKN2基因CpG岛异常甲基化的情况。

　　材料与方法

　　一、标本 收集1997年6月～1998年4月间湖北医科大学附属第一、第二医院手术切除并经病理证实的36例原发性胃癌和22例正常胃组织标本，标本切除后在1小时内放入液氮或-70 ℃中保存备用。

　　二、PCR-甲基化检测 常规苯酚/氯仿/异戊醇提取组织DNA，光密度法测量DNA的含量。用40 units甲基化敏感酶标(Hpa II 37 ℃和Sma I 30 ℃)完全消化1 μg组织DNA 2小时，同时用40 units甲基化敏感酶(Msp I 37℃)消化2小时作为对照。消化后的DNA进行CDKN2基因外显子1的扩增，扩增引物和循环条件参见文献^［3］。产物经溴化乙锭染色，2%琼脂糖电泳，荧光灯下观察结果。统计学分析方法采用χ2检验。

　　结果

　　标本如发生CDKN2基因异常甲基化，甲基化敏感酶Hpa II或Sma I不能切割该序列，PCR扩增CDKN2基因外显子为阳性，而甲基化敏感酶Msp I则可以切割此序列，PCR扩增无产物：无CDKN2基因异常甲基化的标本Msp I、Hpa II和Sma I均可切割，PCR扩增CDKN2基因外显子为阴性。

　　36.1%的胃癌(13/36)CDKN2基因外显子1发生异常甲基化，其中5例(13.9%)在Sma I位点，1例(2.7%)在Hpa II位点，另外7例(19.4%)在Sma I和Hpa II两点均有异常甲基化(见附图)：22例正常粘膜组织中只有1例(4.5%)发生Sma I位点甲基化，胃癌与正常组织之间比较有显著性差异(P＜0.05)(见附表)。

　　附图 Hpa II酶切胃癌标本后CDKN2基因外显子1的PCR扩增

　　1、3、5标本无异常甲基化，酶切后PCR为阴性

　　2、4标本发生异常甲基化，HpaII不能切开，PCR扩增为阳性

　　6 λDNA/Hind III arker

附表 原发性胃癌与正常胃粘膜中CDKN2基因CpG岛甲基化的比较

　　讨论

　　哺乳动物DNA甲基化主要指CG序列被修饰为mCG，甲基化的CG序列参与基因的调控，限制基因的表达。某些致癌因子可激发与细胞增殖周期密切相关的抑癌基因作用，通过抑制mRNA的转录而使该基因失活。肿瘤组织DNA常常有异常甲基化的作用，通过影响染色质结构和癌基因及抑癌基因的表达参与肿瘤的发生发展^［4］。现已发现CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化作用在人的许多常见肿瘤中存在，是其重要的灭活机制之一^［5,6］。但在原发性胃癌中尚未见有关报道。

　　为探讨抑癌基因CDKN2与原发性胃癌的关系及其在胃癌中的灭活机制，作者在用PCR-SSCP法研究了胃癌组织中CDKN2基因突变缺失，发现其纯合性缺失率较低、无突变存在的基础上，首次检测了胃癌和正常胃粘膜组织中CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化的情况，结果发现36.1%的原发性胃癌有CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化现象，与正常胃组织相比有显著性差异(P＜0.05)，说明胃癌中存在的CDKN2基因的变异，5′端CpG岛异常甲基化是其在胃癌中的主要灭活机制。

　　甲基化敏感酶Hpa II和Sma I只能切割CCGG和CCCGGG序列，不能切割CmCGG和CCmCGGG序列；甲基化非敏感酶Mps1则可切割CCGG和CmCGG序列而作为对照。实验结果表明在胃癌中CDKN2甲基化的序列主要在CmCGG和CCmCGGG。PCR-甲基化检测基因5′端CpG岛异常甲基化现象灵敏度高，但可能由于酶切不完全出现假阳性。本实验用过量的酶量(40 units/1 μg DNA)完全消化组织DNA以避免出现假阳性结果。

　　简言之，(1)本实验首次检验了原发性胃癌和正常胃粘膜组织中CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化的情况：(2)首次发现36.1%的胃癌有CDKN2基因异常甲基化，与正常胃组织相比有显著差异(P＜0.05)，认为CDKN2基因甲基化与原发性胃癌的发生发展密切相关；(3)CpG岛异常甲基化是CDKN2基因在胃癌中的主要失活机制，甲基化序列可能主要在CmCGG和CCmCGGG.

　　第一作者简介 全欣鑫，女，在读博士研究生

　　参 考 文 献

　　1 Maesawa C,Tamura G,Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation in association with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,1995,56:3875

　　2 Herman JG,Merlo A,Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancer.Cancr Res,1995,55：4525

　　3 Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436

　　4 Jones PA.DNA methylation errors and cancer.Cancer Res,1996,56:2463

　　5 Gonzalez Zuleta M,Bende CM,Yang AS, et al. Methylation of 5′CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissuescorrelates with gene silencing.Cancer Res,1995,55:4536

　　6 Costello JF,Berger MS ,Huang HS, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation.Cancer Res,1996,56:2405

(收稿：1998-07-01)