胃癌nm23基因mRNA原位杂交和免疫组化研究

肿瘤防治杂志 2000年第1期第17卷 基础与临床研究

作者：姜惠峰　姜颖君　吴荣　王振　孙桂青　丁守怡

单位：姜惠峰　姜颖君　王振　孙桂青（莱阳市山东省烟台市莱阳中心医院　265200）；吴荣　丁守怡（青岛市山东省青岛大学医学院　266021）

关键词：胃肿瘤；nm23-H1基因；mRNA原位杂交；PCNA；免疫组化

　　【摘要】　目的：探讨胃癌mn23-H₁基因表达与淋巴结转移倾向的相关性。方法：采用地高辛标记cDNAnm23-H₁探针，原位杂交检测21例胃癌及癌旁组织；应用单克隆抗体(NM301)SP法检测131例胃癌及60例非胃癌胃粘膜nm23/NDPK表达。结果：原位杂交阳性率57.1%(12/21)；免疫组化阳性率为87.8%(115/131)，其中非转移组阳性率为97.1%(34/35)，转移组阳性率84.4%(81/96)，P＜0.05。结论：胃癌nm23-H₁基因表达与淋巴结转移倾向呈负相关，与PCNA分级呈正相关。

　　中图分类号：R735.2　　　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571(2000)01-0021-05

In situ hybridization and immunohistochemical analysis of expression of nm23-H₁mRNA and its productions in human gastric carcinomas

　JIANG Hui-feng　JIANG Ying-jun　WU Rong　et al

　　（Department of Pathology,Laiyang Central Hospital of Yantai,Laiyang 265200）

　　【Abstract】　Objective:To elucidate the relationship between expression of nm23 gene in human gastric carcinomas and lymph node metastatic potential.Methods:Twenty-one gastric carcinoma tissues and correponding non-cancer mucosae were examined by in situ hybridization with digoxigenin-labeled nm23-H₁cDNA probes.Immunohistochemical staining was made by the Streptoavidin-Biotin method(SP) with mAb nm23/NDPK,131 gastric carcinoma tissues and 60 specimens of non-cancer gastric mucosae were examined.Results:Twelve(57.1%)out of 21 gastric carcinomas expressed higher levels of nm23mRNA than corresponding non-cancer mucosae.One hundred fifteen(87.8%)out of 131 gastric carcinomas exhibited possitive immunoreactivity for nm23/NDPK,97.1%(34/35)and 84.4%(81/96)were immuno-reactivity for non-metastatic groups or metastatic groups,respectively.Statistics analysis was made using the χ² test,the P value was less than 0.05.Conclusions:Expression of nm23/NDPK in gastric carcinomas was inversely associated with lymph node metastatic potential,directively with PCNA labeling index.

　　【Key words】　gastric carcinoma；nm23 gene；mRNA In situ hybridization；proliferating cell nuclear antigen(PCNA)；immunohistochemistry

　　肿瘤转移抑制基因nm23由Steeg等^［1］(1988年)自小鼠黑色素瘤K-1735细胞株中分离出能抑制癌细胞转移的cDNA克隆并命名。此后，在多种动物模型或人类某些实体癌中发现nm23-H₁基因表达水平与肿瘤转移呈负相关^［2～5］，但少数作者的实验结果表明，nm23-H₁基因与转移无关^［6，7］。nm23-H₁基因在胃癌中表达仅见少数报道^［7，8］，结果不一，本组实验应用地高辛标记cDNA探针和免疫组化方法检测石蜡包埋组织中nm23-H₁基因及其表达产物nm23/NDPK在胃癌中的表达，探讨nm23-H₁基因表达与胃癌的临床病理关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本

　　收集烟台市莱阳中心医院1995年10月～1996年12月山东省胃癌根治标本131例(每例标本取材均包括癌及癌旁粘膜)，根据有无淋巴结转移分组，非转移组35例，转移组96例。非癌胃切除标本60例作对照组。标本经10%中性甲醛液固定，常规脱水透明、石蜡包埋，切片厚度5.0 μm。

　　1.2　原位杂交

　　1.2.1　探针　地高辛标记nm23-H₁ cDNA探针购自北京医科大学分子生物学中心，原位杂交试剂盒购自福州迈新生物公司。

　　1.2.2　杂交前预处理　石蜡切片(免疫组化阳性癌组织蜡块)常规脱蜡水化，PBS漂洗5 min×3次，Triton X-100(2 ml/L)/PBS，15 min，蛋白酶K消化(30 mg/L，100 mmol/L Tris -HCl/50 mmol/L EDTA，pH 8.0配制)，37℃，10 min；甘氨酸(1 g/L)/PBS漂洗，5 min，多聚甲醛固定(40 g/L)，5 min；PBS漂洗5 min×2次；以酸酐(2.5 ml/L)/三乙醇胺(100 mmol/L，pH 8.0)处理10 min；乙醇梯度脱水、干燥。

　　1.2.3　预杂交　滴加预杂交液(500 ml/L甲酰胺，4×Denhardt液，20 mmol/L Tris CL，pH 8.0，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0，200 mg/L酵母tRNA)。湿盒内，37℃，2 h。

　　1.2.4　杂交　在上述杂交液内分别加入变性标记nm23-H₁ cDNA探针，变性蛙鱼精DNA(200 mg/L，终浓度)以及葡聚糖(100 mg/L，终浓度)。甩去预杂交液，滴加杂交液，使每张切片探针含量约为10 ng，加盖石蜡膜，湿盒内，42℃，杂交14 h。

　　1.2.5　杂交后预处理　2×SSC(含500 ml/L甲酰胺)内轻轻揭去石蜡膜，系列SSC漂洗(略)；Buffer I/Triton X-100(1 ml/L)漂洗5 min×2次，Buffer I漂洗，5 min；BufferⅡ封闭，30 min；羊抗DigAP，37 ℃，3 h；Buffer Ⅰ/Triton X-100漂洗，10 min×3次；BufferⅢ平衡，10 min；NBT-BCIP(NBT 400 g/L，BCIP 200 g/L用BufferⅢ配制)避光显色，2 h；PBS洗终止显色，系列乙醇脱水、透明、中性树胶封固。

　　1.3　免疫组化

　　1.3.1　试剂来源　采用福州迈新公司提供的即用型抗体(鼠抗，NM301、ZCEA1、PC10)及SP试剂盒。

　　1.3.2　组织抗原微波修复　组织切片脱蜡至水后，3% H₂O₂处理10 min；蒸馏水洗切片3 min×2次；将切片插入耐高温塑料染色架放入盛有已煮沸缓冲液的耐热容器中，继续加热至沸腾(98℃～100 ℃)，持续8～10 min(医用微波炉YMY781B型，2档)；取出容器置室温冷却10 min；先用蒸馏水冲洗两次，再用PBS冲洗3 min×2次，下接免疫组化染色步骤。

　　1.3.3　免疫组化染色　切片经微波修复后，每张切片加1滴过氧化酶阻断液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min；PBS(pH＝7.4)冲洗3 min×3次；每张切片加1滴非免疫性动物血清，室温孵育5 min，PBS冲洗1次；每张切片加1滴第一抗体，室温下孵育60 min；PBS冲洗3 min×3次；每张切片滴加1滴生物素标记的第二抗体；室温下孵育10 min；PBS冲洗3 min×3次；每张切片加1滴链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min；PBS冲洗3 min×3次；每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显色5～10 min；自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗泛蓝，梯度乙醇脱水透明，中性树胶封固。

　　1.4　结果判定及统计学处理

　　原位杂交胞浆出现蓝色颗粒即为阳性；免疫组化染色，癌组织与癌旁和非癌胃粘膜组织染色强度比较，当癌组织染色强度低于非癌组织时为阴性，当癌组织染色强度近于非癌粘膜则为阳性(+)，当癌组织染色强度超过非癌组织染色则为(++)。PCNA分级，阳性细胞核数目＜25%为Ⅰ级，25%～50%为Ⅱ级，50%～75%为Ⅲ级，＞75%为Ⅳ级。应用χ²检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　nm23-H₁基因原位杂交

　　nm23-H₁基因阳性信号为蓝色细颗粒位于胞浆，12例癌组织阳性，阳性率为57.1%(12/21，图1)。

　　2.2　nm23/NDPK免疫组化

　　nm23/NDPK阳性信号为棕色细颗粒状，主要位于胞浆，个别核浆均阳性。非转移组：(++)26例，(+)8例，(-)1例；转移组：(++)33例，(+)49例，(-)15例。癌旁粘膜及非癌粘膜均阳性(图2)。

　　2.3　nm23/NDPK表达与胃癌临床病理关系

　　nm23/NDPK表达与胃癌大体类型、肿瘤浸润深度和范围及CEA表达均无显著相关(P＞0.5、P＞0.25、P＞0.25)；非转移组阳性率97.1%(34/35)，转移组阳性率84.4%(P＜0.05)，提示nm23/NDPK表达水平与淋巴结转移呈负相关；nm23/NDPK表达水平随PCNA分级的增加而升高，提示nm23/NDPK表达与PCNA分级呈正相关；管状腺癌阳性率为93.9%，均高于印戒细胞癌和粘液腺癌(表1)。

　　2.4　nm23/NDPK表达与胃癌病程和临床病理分期的关系

　　nm23/NDPK表达与病人就诊前病程的长短相关，随病程延长nm23/NDPK表达下降，而与临床病理分期无关(表2)。

图1　nm23基因mRNA 阳性信号

图2　nm23/NDPK阳性表达

表1　nm23/NDPK表达与胃癌临床病理关系

　　※腺癌、印戒细胞癌、粘液腺癌比较；△腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比较

表2　nm23/NDPK表达与胃癌病程和临床分期关系

　　3　讨论

　　nm23基因定位于人17号染色体17q21～q22区位^［9］，其编码产物为二磷酸核苷激酶(NDPK)。nm23/NDPK可介导GDP→GTP的转化，而这一过程与细胞增殖调控密切相关的磷脂酰肌醇信号通路系统中的重要中介蛋白——G蛋白的活性有关^［10］。此外，NDPK提供的GTP可直接影响微管、微丝等细胞骨架蛋白的生物活动，通过参与调节细胞内微管系统的状态而抑制癌的转移。nm23基因产物促使微管聚合的作用，而另一种钙结合蛋白——mtsl基因的产物则作用相反，实验证明nm23基因与mtsl基因表达调节相关，两者比值的变化影响细胞中微管的聚合状态，从而改变细胞的粘附和迁移，介导癌转移的发生^［10］。

　　自Steeg等发现癌细胞转移抑制基因nm23以来，有关该基因与肿瘤转移关系的研究日益增多。Tannapfel等^［2］研究100例结直肠癌，发现nm23基因蛋白弱或低表达者，淋巴结转移率高于中度或强表达者，原发灶内nm23低表达者预示有淋巴结转移。Konishi等^［3］检测80例非转移性前列腺癌、12例隐匿性癌和6例伴有转移者，结果显示nm23/NDPK表达与癌转移呈负相关。笔者在乳腺癌的研究发现，nm23/NDPK表达水平与淋巴结转移潜能呈负相关，而与组织学分级无关^［4］。陈晓东等^［5］在肝癌的研究中也发现nm23-H₁ mRNA水平与人肝细胞癌的转移倾向呈负相关。但nm23基因在胃癌中的表达结果不一，Nakayama等^［8］应用Southern印迹、Northern印迹、Western印迹及免疫组化技术在胃癌研究中发现，23例胃癌中只有2例显示nm23杂合子丢失(LOH)；84%(22/26)的原发灶nm23 mRNA表达水平高于非癌粘膜；52%的淋巴结转移灶中nm23表达较原发灶减弱，提示nm23 mRNA和nm23/NDPK高表达与低转移潜能和较好的预后有关。但有的研究显示，nm23基因蛋白表达与胃癌组织的分化程度有一定关系，高中分化者nm23基因表达率高，而低分化者表达低；但与肿瘤大小、部位及周围淋巴结转移均无关。本组资料研究结果显示，nm23/NDPK表达与淋巴结转移呈负相关，与多数报道一致^［2～5］；nm23/NDPK表达与PCNA分级呈正相关，表明细胞增殖旺盛过程中nm23基因容易扩增和被激活；nm23/NDPK表达与组织分化及类型有一定关系，管状腺癌表达明显高于印戒细胞癌和粘液腺癌，而管状腺癌又以高中分化表达高于低分化者，与文献报告相同^［7］。此现象可能与管状腺癌高检出率有关。本研究同时显示术前病程的长短与nm23/NDPK表达呈负相关，而与肿瘤生长类型、侵犯深度和范围及临床病理分期无关，因此nm23/NDPK表达可作为检测胃癌转移、估计预后的参考指标。

　　本研究显示nm23 mRNA表达低于nm23/NDPK表达，且低于文献报告^［5，8］，推测此结果出现的原因与mRNA敏感性下降有关，原因可能为：①cDNA探针检测mRNA的敏感性不高；②石蜡包埋组织细胞的mRNA破坏严重。本组实验结果显示，nm23/NDPK免疫组化能较可靠的反映nm23基因的表达，且方法简单、易操作，可作为肿瘤细胞分子生物学检测的辅助手段，适于基层医院推广应用。

　　本研究结果示，转移组nm23/NDPK阳性表达为84.4%，说明nm23基因，仅可作为临床预示转移潜能的一项生物学观察指标，因为转移是机体内一系列连续的涉及多个宿主-肿瘤相互作用的过程^［8］。随着分子生物技术进步及研究资料的积累，nm23基因在癌转移过程中的作用将会被进一步阐明。

　　基金项目：山东省科委科技攻关项目(961165308C)

　　参考文献：

　　［1］　Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst,1988,80(3):200-216.

　　［2］　Tannapel A,Kockerling F,Latalinic A,et al.Expression of nm23-H₁ predicts lymph node involvement in colorectal carcinoma［J］.Dis Colon Rectum,1995,38(6):651-654.

　　［3］　Konishi N,Nakaoka S,Tsuzuki T,et al.Expression of nm23H1 and nm23H2 proteins in prostate carcinoma［J］.Jan Cancer Res,1993,84(10):1050-1054.

　　［4］　姜惠峰，姜颖君，孙桂青，等.乳腺癌nm23-H₁蛋白表达的研究［J］.齐鲁肿瘤杂志，1997，4(2)：112-113.

　　［5］　陈晓东，戴益民，杨甲梅，等.肿瘤转移抑制基因nm23在人肝细胞癌中的表达［J］.中华病理学杂志，1996，25(2)：76-78.

　　［6］　Luo W,Matsuo K,Nagayama Y,et al.Immunohistochemical analysis of expression of nm23-H₁/nucleoside diphosphate kinase in human thyroid carcinoma:lack of correlation between its expression and lymph node metastasis［J］.Thyroid,1993,3(2):105-109.

　　［7］　刘宝瑞，张学庸，丁杰，等.nm23蛋白在转移性胃癌中的表达［J］.中华病理学杂志，1996，25(5)：307-308.

　　［8］　Nakayama H,Yasui W,Yokozaki H,et al.Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas［J］.Jpn J Cancer Res,1993,84:184-190.

　　［9］　Kelsell DP,Black DM,Solomon E,et al.Localization of a second NM23 gene,NME₂,to chromosome 17q21-q22［J］.Genomics,1993,17(2):522-524.

　　［10］　侯宇，赵利淦，林剑.抑癌基因新发现和致癌机制新观点［J］.国外医学肿瘤学分册，1995，22(2)：65-68.

收稿日期：1999-11-05

　　修回日期：2000-01-27