PCNA在进展期胃癌中表达及与预后关系的研究
肿瘤防治杂志 2000年第3期第17卷 基础研究
作者：刘迂 何泽生 吴金生
单位：刘迂（天津市 300381 中国人民解放军第四六四医院外一科）；何泽生 吴金生（西安市 710038 第四军医大学唐都医院普外科）
关键词：胃肿瘤；增殖细胞核抗原；预后；免疫组织化学
【摘要】 目的：用针对细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的抗体检测进展期胃癌细胞的增殖活力，探讨其表达及与预后的关系。方法：用免疫组织化学方法测定了157例内窥镜活检标本和其中10例手术切除标本及10例正常胃粘膜标本的PCNA标记指数(Labling index,LI)。结果：PCNA在肿瘤的增殖细胞和正常胃粘膜腺体颈部细胞的核内强染色。PCNA LI正常胃粘膜为3.5%～10.6%(6.5±3.4)%，胃癌活检组织12.6%～68.0%(34.2±10.7)%，P＜0.01。在肝脏和淋巴结转移、浆膜侵犯、腹腔播散、肿瘤大于或等于6 cm和组织学分化差的胃癌PCNA LI明显增高(P＜0.01)。高PCNA LI(≥35%)5年生存率明显低于低PCNA LI(＜35%)者(P＜0.01)。结论：PCNA LI是一个重要的和独立的预后指标。
中图分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1009-4571(2000)03-0236-04
Proliferating Cell Nuclear Antigen in Advanced Gastric Cancers and Relationship with Prognosis
LIU Yu,HE Ze-sheng,WU Jin-sheng.
（The First Surgery Derpartment of No.464 Hospital of PLA, Tianjin 300381）
【Abstract】 Objective：That proliferrative activity, as measured by using monoclonal antibody against proliferative cell nuclear antigen(PNCA), is used in advanced gastric cancers and relationship with prognosis.Methods：PCNA labeling index(LI) was quantified by immunohistochemistry on formalih-fixed paraffin embedded biopsy or surgically resected specimens from 157 patients with advanced gastric cancer and from 10 normal gastic mucosa.Ruesults：Immunohistochemic analysis has demonstrated that PCNA reveals an intensive staining in the nuclear of tumor cell and mucosal neek cells of gastic glands. PCNA LI ranged from 3.5 to 10.6%(6.5+3.4)%,in normal gastic mucosa, 12.6%-68.0%(34.2±10.)7% in endoscopic biopsy of advanced gastric cancer(P＜0.01). There was a siginficant correlation between PCNA LI of biopsy and that of resected specimens of gastic cancer(γ＝0.970 2,P＜0.01). PCNA LI was significantly higher(P＜0.01) in slices of tissues from liver and lymphotic metastasis, scrosal invasion, peritoneal metastasis, tumor size≥6cm and histologically poorly-differentiated tomors. The 5-Yr-Survival rate of patients with high PCNA LI(≥35) was significantly poor(P＜0.01)than those with low LI(＜35%).Conclusins：When the PCNA LI and pathologic factors were analyzed by the Cox Regression Model, PCNA LI emerged as an important and independent prognostic indicator.
【Key words】 stomach neoplasms;proliferating cell nuclear antigen (PCNA); Prognosis; Immunogistochemistry
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，占消化道肿瘤的第1位，进展期胃癌预后较差。现在已知许多肿瘤的细胞增殖率与其生物学特性和预后有关［1～4］，使细胞增殖检测在肿瘤的诊断治疗和预后评价显示出潜在的应用价值。近年来，细胞周期相关抗原单克隆抗体的制备，在组织切片上能较快和准确直观的观察到肿瘤的增殖细胞。本研究是用PCNA 单克隆抗体(monoclonal antibody,MoAb)MoAb PC10免疫组织化学方法检测了157例进展期胃癌标本，观察PCNA在胃镜活检组织中的表达，与临床和病理检查结果进行比较，并对63例胃癌应用Cox模型进行生存分析。
1 材料与方法
1.1 标本选择
157例进展期胃癌来自1993～1999年第四军医大学唐都医院的住院手术病人，胃镜活检和手术切除标本组织学检查确诊，其中男116例，女41例；平均年龄为54.1岁。临床分期按国际抗癌联盟(UICC)标准，术后生存5年以上74例，失访11例，随访63例，男45例，女18例。所有病例术前未行化疗及放疗。选择10例胃镜活检的正常胃粘膜。
1.2 标本及切片
选择其中10例胃癌标本活检组织标本及其手术切除标本，所有标本均经福尔马林固定、石蜡包埋。连续切片，厚4 μm,HE染色。
1.3 试剂来源
第一抗体，鼠抗体PCNA PC10 MoAb为DaKo公司产品。第二抗体，兔抗体免疫球蛋白和ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
1.4 免疫组织化学染色
ABC法，组织切片置于涂有防脱胶切片上后37℃恒温箱干燥2 h，二甲苯脱蜡后蒸馏水冲洗5 min；用含30%过氧化氢化学纯甲醇孵化切片30 min以抑制内源性过氧化物酶；用正常小牛血清孵育20 min封闭内源性过氧化酶(自来水冲洗吹干)；加PC10 MoAb稀释液(1∶50)4℃湿盒内室温孵育过夜，PBS冲洗3次5 min；加生物素标记的第二抗体室温孵育60 min；加ABC复合物室温作用30 min，PBS彻底冲洗；DAB-H202显色液染色10 min，(自来水冲洗)苏木素轻度复染；系列酒精脱水，二甲苯透明；DDX封片观察。
1.5 结果测量及统计学处理方法
由两名病理医师双盲法分别观察免疫组织化学染色结果，在高倍镜下(10×40)，观察了4个视野1 000个肿瘤细胞，核内有棕黄色颗粒沉积者为阳性细胞，取其二人计数结果的平均值，用百分率表示PCNA LI阳性率。计算方法：PCNA LI＝阳性肿瘤细胞数/观察的肿瘤细胞总数×100%，检测结果用U检验，直线相关分析。生存率比较时作Kaplan-Meier生存曲线并行Logrank时序检验并以Cox模型计算截断点并做多因素分析。
2 结果
2.1 PCNA在胃癌组织中的表达
157例胃癌活检组织切片均可见PCNA免疫染色，染色较强者棕色物质呈颗粒状分布在细胞核内，染色较浅者细胞核内棕黄色物弥漫分布。少数肿瘤细胞出现胞浆浅染色，PCNALI 12.6%～68.0%(34.2±10.7)%，图1。
图1 157例进展期胃癌PCNA LI分布频数
PCNA阳性细胞在正常胃粘膜分布在腺体颈部增殖带，腺体的表层和基底部少见，PCNA LI为3.5%～10.6%(6.5±3.4)%。
10例胃癌术前胃镜活检组织PCNA LI 28.5%～55.3%(39.8±7.8)%，手术切除标本PCNA LI为29.8%～50.5%(37.6±6.6)%，同组病人两种取材PCNA LI呈正相关(r＝0.970 2，P＜0.01，图2)。
图2 10例进展期胃癌镜检和手术切除
标本组织PCNA LI之间的关系(r=0.970 2)
PCNA LI与组织学检查结果之间的关系 分析显示，在肿瘤大于或等于6 cm与小于6 cm，是否有浆膜浸润和淋巴结转移、肝转移以及是否腹腔播散之间PCNA LI差异显著(P＜0.01)，组织学分化好(高、中分化)的胃癌低于分化差(低分化及粘液腺癌印戒细胞癌)的胃癌PCNA LI(P＜0.01)。PCNA LI在Borrmann分型之间无显著差异(P＞0.05，表1)。
表1 增殖细胞核抗原标记率(%)和临床病理改变之间的关系
| 项目 |
肝脏转移 |
淋巴转移 |
分型 |
肿瘤大小 |
组织学分化 |
侵犯浆膜 |
腹腔播散 |
| 阳性 |
阴性 |
阳性 |
阴性 |
Ⅰ～Ⅱ |
Ⅲ～Ⅳ |
＜6 cm |
≥6 cm |
好 |
差 |
阳性 |
阴性 |
阳性 |
阴性 |
| 病例数 |
27 |
130 |
128 |
29 |
77 |
80 |
83 |
74 |
67 |
90 |
98 |
59 |
44 |
113 |
 |
39.8 |
32.9 |
35.6 |
27.6 |
34.5 |
36.7 |
29.8 |
39.1 |
27.6 |
39.2 |
37.8 |
27.7 |
40.9 |
31.6 |
| ±s |
8.9 |
10.7 |
10.3 |
10.7 |
9.3 |
10.2 |
9.5 |
10.0 |
|
8.1 9.8 |
9.9 |
9.9 |
9.4 |
10.1 |
| P值 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＞0.05 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
2.2 PCNA LI与胃癌预后的关系
2.2.1 PCAA LI与胃癌生存时间的关系 术后超过5年并有随访结果的63例胃癌根据PCNA LI分为两组，大于或等于35%(截断点)为高增殖组，共25例，死于肿瘤复发或转移21例，PCNA LI为(41.8±7.2)%，其5年生存率为16%，38例小于35%为低增殖组，死于肿瘤者15例，PCNA LI为(25.2±6.5)%，5年生存率为58%。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线(图3)，经Logrank时序检验两者差异显著(P＜0.01)。
图3 63例进展期胃癌根据PCNA LI分组生存曲线
2.2.2 PCNA LI判断胃癌预后的价值 将组织学检查结果和性别、年龄、以及PCNA LI等12项因素作为预后分析指标，将各项指标数量化后输入计算机作COX回归分析，单因素回归分析所有变量与预后相关，多因素回归分析显示病人年龄和性别并没有独立的预后价值，而肝脏转移、腹腔播散是重要的指标，其次是PCNA LI和临床分期、组织学分化、肿瘤大小、淋巴结转移、Borrman分型、断端残留、浆膜侵犯也与预后有关(表2)。
表2 63例胃癌预后因素的单因素和多因素分析
| 变量 |
单因素分析 |
多因素分析 |
| Z值 |
P值 |
F值 |
P值 |
| 性别 |
男
女 |
2.096 |
0.039 |
0.282 |
0.543 |
| 年龄 |
＜55
≥55 |
2.091 |
0.041 |
0.389 |
0.612 |
| 临床分期 |
Ⅰ、Ⅱ
Ⅲ、Ⅳ |
3.856 |
0.001 |
7.215 |
0.008 |
| PCNA LI |
＜35
≥35 |
3.995 |
0.001 |
7.312 |
0.008 |
| 肝脏转移 |
阳性
阴性 |
4.713 |
0.001 |
12.864 |
0.001 |
| 淋巴结转移 |
阳性
阴性 |
4.984 |
0.001 |
5.416 |
0.022 |
| Borrmann |
Ⅰ、Ⅱ
Ⅲ、Ⅳ |
3.618 |
0.001 |
5.253 |
0.024 |
| 肿瘤大小(cm) |
＜6
≥6 |
5.645 |
0.001 |
5.314 |
0.023 |
| 组织学分化 |
好
差 |
2.103 |
0.036 |
6.478 |
0.017 |
| 浆膜侵犯 |
阳性
阴性 |
6.073 |
0.001 |
4.376 |
0.039 |
| 腹腔播散 |
阳性
阴性 |
2.102 |
0.036 |
10.746 |
0.001 |
| 断端残留 |
阳性
阴性 |
4.624 |
0.001 |
4.310 |
0.042 |
3 讨论 胃癌的预后依赖于临床分期，而临床分期又基于肝转移、胃壁浸润和淋巴结受累状态。近年来，已有许多方法用来估计病人的预后，如DNA倍体FCM检测和增殖细胞检测，在肿瘤的众多因素中增殖率被认为是预测生存的重要指标［5］。传统的 3HTDR放射自显影方法存在着耗时费力和放射性污染的缺陷，BrDU限于在活体组织，而Ki67只能用于冰冻的新鲜组织，因而限制在临床的应用。PCNA是相对分子质量23×103非组蛋白性核蛋白，仅在增殖细胞合成与表达，做为DNA-P的辅助蛋白为DNA合成中所必需的物质［6］，其合成与表达和细胞增殖周期相关，PCNA在G1期合成增加，S期达到高峰，G2期开始下降［7，8］。PCNA的MoAb已有11种，其中PC10可用于福尔马林固定石蜡包埋的组织，在切片上可直接观察组织形态，重复性好，可进行回顾性研究。肿瘤细胞群体中处于S期细胞的比值被认为是精确的代表肿瘤增殖率，3H-TDR和BrDU所检测的肿瘤细胞只反应S期，PCNA在S期为强染色，但在G1G2期也可被检测到，所以PCNA LI往往优于其他方法，但是与其他方法仍然有良好的相关性［9～11］。PCNA的表达与组织离体后固定的时间和固定剂种类有关［6，10，12］PCNA在标本固定之前可能会部分降解，免疫组织化学染色可能出现部分阳性。而活检组织在离体后立即固定，免疫反应比较一致，我们选择了10例胃癌病人同时对两种取材检测PCNA，结果相关性很好。检测结果表明，PCNA LI准确地反映了胃癌细胞的生物学特性，在出现肝转移、淋巴结转移、浆膜浸润、腹腔播散和瘤体较大(≥6 cm)的肿瘤PCNA LI较高；组织学分化好的胃癌PCNA LI低于分化差的胃癌，表明胃癌细胞增殖率比组织学分型更能代表肿瘤细胞的侵袭性。COX模型多因素分析表明，PCNA LI是一个独立的可靠的预后指标。总之高PCNA LI的胃癌病人具有较大的侵袭性，需要更积极的治疗。用PCNA MoAb PC10在常规病理切片上检测胃癌细胞的增殖率是一个简单、可靠的方法，可获得肿瘤的细胞动力学资料以了解其生物学特性和推测预后。选择活检组织切片使临床医师可以在手术前参照肿瘤的增殖状态设计个体手术方案和术后多形式的治疗。
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收稿日期：2000-02-01 修回日期：2000-03-04
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