维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理

　　中华肿瘤杂志2000年第22卷第3期

　　吴乔　陈正明　刘苏　苏文金

　　摘　要　目的　探讨维甲酸α受体(RARα)介导全反式维甲酸(ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法　应用Northern blot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平，通过脂质体转染方法将sense rARα和antisense RARα分别转染到细胞中，通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响，瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性，分析维甲酸应答元件（RARE)的转录活性。结果　ATRA诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导MKN-45细胞RARα表达。在转染细胞中，ATRA可以抑制转sense rARα的MKN细胞生长，但不能抑制转antisense RARα的BGC细胞生长。与MKN-45细胞比较，ATRA诱导MKN/RARα细胞βRARE的转录活性较高，但与BGC-823细胞比较，ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。结论　足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的。

　　主题词：胃肿瘤；维甲酸；维甲酸α受体；基因转染

　　维甲酸(retinoic acid, RA)的作用主要由其受体——维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)和维甲类X受体(retinoid x receptor, RXR)介导，它们属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员，由3种不同基因α、β和γ编码，由此形成不同的受体亚类^［1］。许多证据表明，RAR活性的改变与某些疾病相关。在急性早幼粒细胞白血病中，当染色体发生t(15；17)易位时，导致异常PML-RARα融合受体的产生，并引起非正常的RARα转录^［2］。在肺癌中，靠近RARβ基因区的染色体3P短臂经常发生缺失^［3］，人乳腺癌细胞由于不表达RARβ而对RA产生抗性^［4］。因此，探讨RAR的功能作用对于阐明RA的抗癌机制具有重要意义。

　　材料与方法

　　1.胃癌细胞株和药物处理：BGC-823和MKN-45细胞购于上海细胞所细胞库，RPMI-1640培养液培养。10^-6 mol/L全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA; Sigma公司)处理细胞。

　　2.RNA提取和Northern blot：细胞经ATRA处理24 h后，硫氰酸胍提取和氯化铯超速离心制备总RNA，Northern blot按文献［5］方法。探针RARα、RARβ、RARγ和RXRα由美国加州Burnham研究所张晓坤博士惠赠。以28S和18S定量所用的RNA量。

　　3.基因转染和细胞形态观察：克隆有antisense RARα和sense RARα质粒的表达载体(张晓坤博士惠赠)通过脂质体(Gibco bRL)介导方法转染到细胞中，空白载体(pRC/CMV)作为对照，G418筛选细胞，Northern blot确定RARα表达，观察克隆细胞形态。

　　4.细胞生长测定：以1 000细胞/孔接种量将细胞接种在96孔板，ATRA处理细胞9 d，MTT［3-(4,5-dimethylthiazol-6-yl)-6,5-diphenyltetrazolium bromide］方法测定细胞生长率^［6］。

　　5.软琼脂集落形成测定：0.5%琼脂作为底层，在0.3%琼脂中加入细胞，使细胞终浓度为1×10⁵/ml(实验组则同时加入ATRA)，混匀后取1 ml铺展在底层琼脂上，凝固后置CO₂培养箱中培养，3周后计数集落形成数(直径＞80μm集落为阳性)。

　　6.DNA瞬时转染和氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定：脂质体介导方法将报告基因β rARE-tk-CAT(张晓坤博士惠赠)瞬时转染到细胞中，转染后，细胞经ATRA处理24 h，测定CAT活性^［6］。

　　结果

　　1.RARα、RARβ、RARγ和RXRα在胃癌细胞中的表达：Northern blot分析表明，RARα在BGC-823细胞中表达水平较高，在MKN-45细胞中表达水平很低。ATRA诱导后，BGC-823细胞RARα表达水平显著提高，而MKN-45细胞RARα表达水平不变。RARβ在BGC-823细胞表达，在MKN-45细胞不表达；RARγ在两株细胞中均不表达，RXRα在两株细胞中低水平表达。然而，ATRA都不能诱导两株细胞的RARβ、RARγ和RXRα表达(图1)。

　　2.转染基因在胃癌细胞中的表达：根据以上结果，将antisense rARα和sense RARα分别转染到BGC-823和MKN-45细胞。Northern blot显示，BGC/aRARα细胞的RARα表达受到抑制，表达水平比BGC-823细胞低，而且ATRA不能诱导其表达，但可以诱导转空白载体细胞BGC/vector的RARα表达(图2A)。相反，MKN/RARα细胞的RARα表达不仅比MKN-45细胞提高，而且ATRA能够诱导其表达，但不能诱导MKN/vector的RARα表达(图2B)。与MKN-45细胞多边形形态比较，MKN/RARα细胞变为细长形，突起消失，圆形细胞增多，而BGC/aRARα细胞形态则与BGC-823细胞类似。

图1　ATRA对胃癌细胞中RARα、RARβ和RXRα转录水平的影响

A：BGC/aRARα细胞；B：MKN/RARα细胞图2　RARα在转染细胞中的表达

　　3.ATRA对细胞生长的影响：ATRA可以有效抑制BGC-823细胞生长，但不能有效抑制BGC/aRARα细胞生长，抑制率从61.0%下降到18.4%。相反，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长，但可以抑制MKN/RARα细胞生长，抑制率从3.9%上升到31.7%。

　　4.ATRA对细胞软琼脂集落形成能力的影响：ATRA可以抑制BGC-823和MKN-45细胞在软琼脂中形成集落的能力，但对BGC-823细胞的抑制率(35.7%)比对MKN-45细胞的抑制率(23.2%)高。相反，转染细胞中ATRA对MKN/RARα细胞形成集落的抑制率(96.1%)大于BGC/aRARα细胞(20.0%)。

　　5.ATRA对维甲酸应答元件βRARE转录活性的调节：当报告基因βRARE-tk-CAT瞬时转染后，在BGC-823细胞中，ATRA可以诱导一个较强的CAT活性，诱导倍数(即ATRA诱导的CAT活性/对照组的CAT活性)为3.36，而对MKN-45细胞的诱导倍数为1.3。相反，转染细胞中ATRA不能显著诱导BGC/aRARα细胞的CAT活性,诱导倍数仅为1.8，但对MKN/RARα细胞的诱导倍数则上升为2.75。

　　讨论

　　RA的作用主要由其受体RAR_S和RXR_S介导。Northern blot分析表明，ATRA可以诱导BGC-823细胞RARα表达，但不能诱导RARβ、RARγ和RXRα表达，提示RARα可能参与ATRA抑制胃癌细胞生长的过程。RA激活的RARα与RXR形成异源二聚体，可以结合到维甲酸应答元件(如βRARE)上，由此调控基因的转录和表达^［4］。在急性早幼粒白血病细胞和RA抗性的成神经细胞瘤细胞中，RA可以诱导RARα表达，这种上调作用是由于RA诱导RARα基因启动子上的RARE基元序列(motif)^［7］。本研究中，当报告基因βRARE-tk-CAT转染到BGC-823细胞时，ATRA可以显著诱导βRARE活性(即CAT活性)，表明BGC-823细胞的RARα具有功能性，在ATRA存在下激活βRARE而刺激细胞生长抑制信号，从而抑制BGC-823细胞生长。但是，当报告基因转染到MKN-45细胞时，ATRA诱导的βRARE活性很低，提示在MKN-45细胞中βRARE转录调节可能发生异常，或者RARα功能丧失，ATRA不能抑制MKN-45细胞生长。

　　在成神经细胞瘤中，低水平表达RARα与预后效果差密切相关^［8］，这是由于RARα受体反映了肿瘤分化的特殊阶段。已知RARα在人组织分化过程中具有重要作用，在造血细胞中，RARα表达丰富，但当染色体发生t(15;17)和t(11;17)易位时，RARα受体发生变化，导致造血细胞分化受阻^［9］。当将sense rARα基因转染到MKN-45细胞时，ATRA通过对RARα的诱导而抑制细胞生长和降低细胞形成集落的能力。相反，当antisense rARα转染到BGC-823细胞后，ATRA不能诱导RARα表达，细胞由对ATRA敏感转为抗性，形成集落的能力上升。由此证实，RARα在介导ATRA抗胃癌细胞生长和抑制细胞恶性化方面起着关键作用。RARα功能丧失可能导致细胞失去这种调节机制，从而表现出对ATRA抗性。

　　另外，当RARα基因转染到MKN-45细胞后，细胞形态由多边形变为细长形，圆形细胞数量增多，这种变化与ATRA存在与否无关，表明细胞形态的改变是由于基因转染引起的。至于圆形细胞的增多是否与细胞凋亡或其他因素有关，尚需进一步研究。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39880015)；国家杰出青年科学基金(B类)资助项目(39825502)

　　作者单位：吴乔（361005厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

　　陈正明（361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

　　刘苏（361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室)

　　苏文金（361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室）

　　参考文献

　　1．Zhang XK, Pfahl m. Regulation of retinoid and thyroid hormone action through homodimeric and heterodimeric receptors. Trends Endocrinol Metab, 1993, 4:156-162.

　　2．Grignaini F, Fagioli M, Alcalay M, et al. Acute promyelocytic leukemia from genetics to treatment. Blood, 1994, 83:10-17.

　　3．Gebert JF, Moghal N, Frangioni JV, et al. High frequence of retinoic acid receptor βabnormalities in human lung cancer. Oncogene, 1991，6:1856-1863.

　　4．Lui Y, Lee MO, Wang HG, et al. Retinoic acid receptor β mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 1996, 16:1138-1149.

　　5．Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. 10-11.

　　6．吴乔，曾定，苏文金，等.视黄酸受体转录水平的改变与乳腺癌细胞生长的关系.厦门大学学报(自然科学版)，1997，36：787-794.

　　7．Smarda J, Sugarman J, Glass C, et al. Retinoic acid receptor alpha suppresses transformation by v-myb. Mol Cell Biol, 1995, 15:2474-2492.

　　8．Marshall GM, Cheung B, Stacey KP, et al. Regulation of retinoic acid receptor alpha expression in human neuroblastoma cell lines and tumor tissue. anticancer Res, 1993, 13:437-449.

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