¹⁸⁸Re标记抗胃癌单克隆抗体3Hll的研究

中华核医学杂志 1999年第3期第19卷 临床与实验研究

单位：100036　北京医科大学临床肿瘤学院，北京市肿瘤防治研究所

　　目前，用于放射免疫治疗的核素主要有¹³¹I和发射纯β射线的⁹⁰Y。由于¹³¹I体内脱碘和对周围有较大辐射量及⁹⁰Y对骨髓有较大毒副作用等，限制了其使用^［1,2］。目前人们更多的进行与⁹⁹Tc^m同副族Re的同位素¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re的研究。

　　¹⁸⁶Re系反应堆生产的有载体核素，抗体消耗量大，成本高，标记过程复杂,且受供货时间限制。近年来，¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器的研制成功，解决了无载体¹⁸⁸Re核素来源。¹⁸⁸Re物理半衰期为17 h，能发射β射线和155 keV的γ射线，是目前较为理想的具有治疗和诊断双重功能的核素^［3,4］。¹⁸⁸W的半衰期69 d,使子体¹⁸⁸Re来源方便和充足，进行¹⁸⁸Re标记单克隆抗体放射免疫治疗研究具有重要意义。

　　材料与方法

　　1. 试剂和仪器。SnCl₂，2-巯基乙醇（2-ME）分析纯，Sigma公司，¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器（上海科兴药业公司），快速薄层层析硅胶纸(ITLC-SG，美国），GENESYS-2紫外分光光度计（美国），FA1004电子天平（上海）， FH-408定标器（北京261厂），PROTEAN Ⅱ电泳仪（美国），γ相机（Sopha）。

　　2. 抗体的制备和还原。将抗胃癌的杂交瘤细胞株0.2 mL（10⁶/mL）注射到SPF级的BABL/c小鼠（18～20 g）腹腔内，标准饲养，7～10 d后处死，取腹水。纯化分离腹水，用饱和硫酸铵沉淀、离心透析除盐，过离子交换柱和凝胶分离柱分离纯化，定氮,分装低温保存，备用。取纯化分离的抗体l mg （0.2 mL），加入2-ME进行预处理^［5,6］，纯化后保存待用。

　　3. 抗体的标记。将从¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器淋洗下来的¹⁸⁸Re溶液0.1～2.0 mL(约185～1 110 MBq),加到含有亚锡保护剂的SnCl₂溶液中，摇匀后用醋酸缓冲液调pH值至5.0左右，然后将此溶液加至已还原的抗体中，室温反应0．5～6 h,用ITLC-SG或柱层析监测标记率，并进行纯化分离。柱纯化用0.05 mmol/L醋酸缓冲液做淋洗液,用ELlSA测定标记抗体的免疫活性。

　　4. 标记率测定。柱层析：采用Se-phadex G-50柱（100 mm×8 mm），用0．05 mmol/L醋酸缓冲液淋洗，上柱体积0．2 mL，收集各淋洗液于0．5 mL的试管中，共20管，分别测定各管中放射性和280 nm处紫外吸收值。将ITLC-SG纸剪成10 cm×1．0 cm的小条，于110 ℃的烘箱中烘烤30 min，置于干燥器中密封保存待用。将标记溶液1～2 μL点于活化的ITLC-SG距底端l cm处，2 min后分别置于2种体系中上行展开。第1个在生理盐水体系中，游离¹⁸⁸Re迁移到前沿，标记抗体在原点；第2个为水∶乙醇∶氨水＝5∶2∶1体系，在点样纸条点上质量分数5％的白蛋白(HSA)后点样。胶体在原点，其余展开到前沿。当展开到10 cm左右，吹干，剪成10条，于定标器中测定放射性。

　　5. 标记物电泳分析。配电泳胶，加入Marker、原始抗体、还原后的抗体和标记后抗体各2～5 μL，然后置于电解槽中，在110 V电压下电解30 min左右。将含放射性部分的胶带剪下，抽干，用富士感光胶片压片进行放射自显影，约10 min后取出，冲洗。另将剩余部分进行染色后再脱色，烘干即可获得清晰的不同相对分子质量的蛋白带。

　　6. 标记物的体外稳定性。将标记物¹⁸⁸Re-3Hll加到质量分数为0．9%的生理盐水或5%的HSA的密封管中，在37℃的恒温水浴中孵化1～24 h，用ITLC-SG测定标记化合物中¹⁸⁸Re的脱落情况。为了观察过量还原剂对稳定性的影响，观察用柱层析分离后的标记物在前述相同条件下的稳定性。

　　7. ¹⁸⁸　Re-3H11生物体内分布。给6～7周龄裸鼠于右腋下注射1×10⁶个823胃癌细胞株0．1 mL，无菌恒温环境中饲养，约10 d后瘤子长至100 mg左右。尾静脉注射标记抗体¹⁸⁸Re-3Hll 7．4 MBq（0.1 mL），于注射后不同时相：24、48、72和96 h从眼球取血后扭断颈椎至死，在此之前用γ相机静态观察不同时相肿瘤摄取情况，然后解剖，取心、肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨、肿瘤等组织，称重，测放射性。同时将同等注射剂量的放射性标记物按不同浓度稀释，于同等条件下测定其放射性计数，获得注射剂量的总放射性计数。计算%ID/g。

　　结果

　　经生物检定,本抗体符合无菌无热原要求，抗体纯度大于95%,二聚体含量小于1%,亲和常数K_d=5.68×10⁹ L/mol。37 GBq的¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器用10 mL质量分数为0.9%的生理盐水淋洗，淋洗效率＞80%，¹⁸⁸W的漏穿率＜1×10^-6。当亚锡与抗体物质的量比＜600时,标记率仅为55%左右,而游离¹⁸⁸Re含量＞20%。本研究的最佳配比为亚锡与抗体物质的量比1 100∶1(即1 mg抗体需加入1.4 mg SnCl₂)。

　　由于加入大量亚锡,抗体易沉淀变性,因此需加入亚锡保护剂。本实验采用每1 mg SnCl₂加入5 mg羟乙基二磷酸盐或10 mg葡庚糖酸钠，SnCl₂与酒石酸的质量比为1∶7.2。这样在标记反应总体积＜2 mL,反应2.0 h时,1 mg抗体能结合555 MBq的¹⁸⁸Re,标记率＞95%。

　　1 mg 3Hll抗体用370 MBq ¹⁸⁸　Re标记,标记率随反应时间的延长而增高,1.5 h达95.0±1.8,2 h达97.0±1.1,3 h为98.0±1.8,1.5～3.0 h间变化不明显,故一般选择1.5～2.0 h即可。

　　Sephadex G50柱分离纯化标记抗体，淋洗体积与放射性峰以及280 nm处紫外吸收峰一致，表明¹⁸⁸Re结合在抗体分子上,且杂质峰很少。

　　标记前后各抗体的电泳分析结果显示：用2-ME还原后的抗体和标记抗体与原始抗体的电泳谱带一致，未见碎裂的抗体分子。标记抗体电泳谱带的放射性自显影结果也一致。表明标记抗体能保持其完整性。用ELISA法测得标记抗体的活性＞75％。

　　标记抗体的体外稳定性实验表明：¹⁸⁸Re-3Hll在37 ℃水浴中放置24 h，无论在生理盐水还是在HAS中，放射性脱落率均＜5％，示标记物在体外稳定。

　　动物体内分布结果为:注射¹⁸⁸Re-3Hll 24 h后,肿瘤摄取较其他脏器多,24～48 h达到最高，达7.7％左右；其后随着时间的延长，肿瘤摄取逐渐降低，但T/NT比值逐渐增高。24、48、72和96 h瘤/血比值分别为1.15±0.03、2.45±0.55、2.71±0.53和2.94±0.35；瘤/肝比值分别为3.50±0.81、5.55±0.95、6.93±0.62和7.52±0.35。48 h后，所有T/NT比值均大于2.0。

　　应用γ相机观察不同时相肿瘤摄取¹⁸⁸Re-3Hll的情况(图1)为：早期3 h时几乎看不到肿瘤显影，20 h时肿瘤显影比较清晰，到28 h和44 h时非常清晰。

图1　不同时相荷瘤裸鼠对¹⁸⁸Re-3Hll的摄取

　　讨论

　　¹⁸⁸　Re尽管和⁹⁹Tc^m同处一个副族，但其标记抗体的条件却有较大区别。⁹⁹Tc^m可以在较高pH值和微量亚锡条件下进行标记，并能获得高的标记率（＞95％），而¹⁸⁸Re则需在较低pH值和100倍甚至200倍于⁹⁹Tc^m还原亚锡的用量，才能充分还原¹⁸⁸Re。其次，由于还原¹⁸⁸Re时加大了Sn用量，因此需加入适当的络合剂和亚锡稳定剂，以防止抗体沉淀变性和亚锡的水解。

　　¹⁸⁸　Re-3Hll荷瘤裸鼠肿瘤摄取在48 h后逐渐降低，表明有部分¹⁸⁸Re从抗体上脱落，但T/NT比值随着时间延长而增高，示血液清除比¹³¹I-3H11快,这可能更有利于降低骨髓毒性和其他正常组织的吸收剂量。¹⁸⁸Re-3Hll在胃癌细胞株的靶向定位中T/NT比值高,对导向治疗有利。

　　参考文献

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（收稿：1998-09-10　　修回：1998-11-12）