FasL在食管癌中的表达—一种免疫反攻击机制

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第12期

刘政国　银平章　王宝梅　孔令非　赵跃武

　　摘　要 目的：研究食管癌细胞Fas配体（FasL）的表达情况及其与食管癌发生和预后间的关系。方法：用免疫组化法，检测了40例食管癌原发灶和17例淋巴结转移灶中FasL在食管癌细胞及肿瘤浸润淋巴细胞（TiL）中的表达情况。结果：34例（85％）原发性食管癌细胞中均有不同程度的FasL的表达，31例（82.5％）TiL细胞FasL亦表达阳性，17例淋巴结转移灶癌细胞中，FasL均强阳性表达。结论：食管癌细胞可能通过FasL的表达，杀伤TiL，以达到免疫逃逸及免疫反攻击，对食管癌的形成及转移具有重要的作用。

　　关键词：食管癌 淋巴细胞 肿瘤浸润 FasL

　　Fas配体（FasL）及Fas（也称Apo－1,CD95）^[1]，分属于TNF及TNFR家族，FasL识别并结合细胞表面的Fas，可介导Fas＋细胞的凋亡。已知，活化的CTL及NK细胞表达FasL，而非淋巴系FasL的表达仅限于免疫优势部位（如眼睛前房的细胞，睾丸曲细精管滋养上皮细胞等）^[2]，但现有证据表明肿瘤细胞亦可表达FasL，并被认为是肿瘤细胞进行免疫反攻击的重要机制^[3]。本文对食管癌FasL的表达及其与食管癌发生及转移间的关系进行了初步探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　收集我院1997～1998年间送检的食管癌手术标本存档蜡块40例，复习HE切片，挑选癌与癌旁交界处蜡块。40例病例均经病理诊断为食管鳞癌，其中高分化鳞癌6例，中分化鳞癌31例，低分化鳞癌3例。同时选取淋巴结转移癌蜡块17例。用中性福尔马林固定及常规包埋。患者平均年龄56.18岁（32～78岁），男女之比13:7。术前未做过任何化疗和放疗。

　　1.2　免疫组织化学染色

　　切片厚3μm，采用SP法染色。切片脱蜡，经梯度酒精水化至蒸馏水后，用3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶1小时，蒸馏水洗2次，PBS洗2次，进行FasL检测的片子，用高压锅修复10分钟，室温冷却20分钟，PBS洗3次，用1:20马血清封闭，37℃30分钟，滴加多克隆抗FasL抗体（稀释度1:200，购自美国ZYMED公司），湿盒内4℃过夜，37℃升温1小时，PBS洗3次，加1:200生物素标记的IgG（二抗），37℃温育30分钟，再经PBS洗3次，加1:200链霉素卵白素（二抗、三抗，购自法国IMMUNOTECH公司），37℃温育30分钟，PBS液彻底浸洗，DAB显色，苏木素淡复染，常规脱水，透明，封固。用已知阳性切片做阳性对照；用PBS代替一抗做阴性对照。

　　1.3　阳性结果判断

　　在不知任何临床和病理资料的情况下，对免疫组化切片进行评估。以在食管癌细胞、正常粘膜细胞及肿瘤浸润淋巴细胞胞膜及胞浆上出现棕黄色物且其染色强度高于背景非特异染色者为该部位阳性。

　　根据阳性细胞占全部同类细胞的比例将其分为：1)未见阳性细胞为(－);2)阳性细胞＜25％为(＋);3)阳性细胞占25％～50％为(＋＋)；4)阳性细胞占50％～75％为(＋＋＋);5)阳性细胞＞75％为(＋＋＋＋)。

　　1.4　统计学处理

　　采用χ²检验，取P＜0.05为差异具显著性的标准。

　　2　结果

　　2.1　FasL在正常食管粘膜及食管癌细胞中的表达

　　FasL在10例正常食管粘膜中均阳性表达（图1），表达部位局限在食管粘膜的基底层及基层上方。

图1　正常食管粘膜中FasL均阳性表达，表达部位局限在食管粘膜的基底层及基层上方

　　40例食管癌中，34例有不同程度的表达，阳性率为85％（图2），FasL抗原均匀分布在胞膜及胞浆中。FasL的表达情况见附表，与细胞的分化程度、肿瘤浸润深度及淋巴结转移间均无明显的相关性（P＞0.05）。

图2　食管鳞癌细胞FasL阳性表达，棕黄色颗粒定位于胞膜及胞浆

附表　原发性食管癌FasL的表达

　　2.2　FasL在肿瘤周围浸润淋巴细胞中的表达

　　40例癌组织中均有不同程度的肿瘤浸润淋巴细胞（TiL）浸润，绝大多数TiL存在于癌与正常组织交界处，部分位于癌间质中，癌实质中相对少见。其中3例除存在于癌间质外，还广泛浸润于癌实质中。应用免疫组化染色发现，31/40(82.5％)的TiL细胞FasL表达阳性。

　　2.3　FasL在淋巴结转移癌中的表达

　　为进一步探讨Fas、FasL在食管癌淋巴结转移中是否具有一定的作用，我们对17例淋巴结转移癌进行了免疫组化染色，发现17例转移癌中FasL均强阳性表达（图3），阳性细胞均＞75％。

图3　淋巴结转移癌细胞FasL阳性表达

　　3　讨论

　　肿瘤细胞大量扩增直至肿瘤形成的先决条件是逃避机体的免疫监视，除了应用被动的机制逃避免疫细胞的识别，如下调表达MHCI类分子^[4]；缺乏或低表达共刺激分子B7^[5]；分泌免疫抑制因子如TGF－β^[6]。最近研究表明，肿瘤细胞尚可通过表达FasL，杀伤活化的淋巴细胞。Gloria等^[7]报道14/15的原发性肺癌，7/7的乳腺癌，6/6的结肠癌，6/7的肾癌，7/7的头颈部肿瘤中均有FasL的表达。Hahne^[8]等研究发现，恶性黑色素瘤细胞不仅表达FasL且可诱导Fas＋的T细胞发生凋亡。将表达FasL的黑色素瘤细胞注入小鼠皮下，其成瘤速度显著高于FasL阴性组；相反，将其注入Fas缺陷的Lpr突变鼠体内（其免疫效应细胞不能被FasL杀伤），成瘤速度显著延迟。本实验研究40例食管癌标本，发现34例（85％）有不同程度的FasL的表达，与文献报道一致。同时，我们也观察到肿瘤周围浸润淋巴细胞31/40(82.5％)的病例中FasL表达阳性，FasL＋的肿瘤细胞与FasL＋的TiL细胞相互作用，其结果主要取决于他们对Fas介导凋亡的相对敏感性。许多肿瘤细胞Fas抗原表达下调或完全缺失^[9]，文献报道^[10]即使部分Fas阳性的肿瘤细胞亦能对FasL介导的凋亡有抗性，原因可能是FAP－1蛋白的表达，干扰了Fas凋亡信号的传导；sFas与FasL的结合，以及有些原癌基因如bcl－2,bcr－ab1等的活化，可部分或完全阻断Fas凋亡的下游瀑布，而绝大多数激活的淋巴细胞均表达Fas抗原，且对FasL介导的凋亡有一个易感窗口期^[11]，故肿瘤细胞通过其Fas抗原的下调表达及对FasL介导凋亡的抗性而对活化的TiL细胞发生免疫反攻击。肿瘤细胞利用FasL的表达杀伤TiL，如眼前房及睾丸一样，形成了一个免疫特赦区，对肿瘤的最终形成创造了条件。

　　为了进一步研究FasL在肿瘤转移中的作用，我们对淋巴结转移癌进行了研究，发现FasL在17/17(100％)的转移癌细胞中表达，故推测FasL在肿瘤转移中发挥着一定的作用。

　　总之，食管癌细胞通过FasL的表达，杀伤TiL，以达到免疫逃避及免疫反攻击，对食管癌的形成及转移具有重要的作用。如何阻断肿瘤细胞对TiL的杀伤，还有待于对淋巴细胞激活机制及共刺激分子在其充分活化并抵抗Fas介导凋亡作用的更深入的研究。

　　作者单位：河南省人民医院病理科（郑州市450003）

　　参考文献

　　1 Takashi Suda,Tomohiro Takaahashi,Pierre Golstein,et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand,a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell,1993;75(17):1169

　　2 Griffith TS, Ferguson TA. The role of FasL－ induced apoptosis in immune privilege. Immunol Today,1997;18(5):240

　　3 O′connell J,O′ sullivan GC,Collins JK,et al. The Fas counterattack:Fas－ mediated T cell killing by colon cancer cells expressing Fas ligand. J Exp Med,1996;184:1075

　　4 Restifo NP,Esquivel F,Kawakami Y,et al. Identification of human cancers deficient in antigen processing. J Exp Med,1993;177:265

　　5 Chen L,Ashe S,Brady WA,et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counter recepter for the lymphocyte molecules CD28 and CTL－ 4. Cell,1992;71:1093

　　6 Sulitzeanu D. Immunosuppressive factors in human cancer. Adv Cancer Res,1993;60:247

　　7 Niehans GA,Brunner T,Frizelle SP,et al. Human lung carcinomas express Fas ligand. Cancer Res,1997;57(15):1007

　　8 Hahne M,Rimoldi D,Schroter M,et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo－ 1/CD95) ligand:implications for tumor immune escape. Science,1996;274:1363

　　9 Leithanser F,Dhein J,Mechtersheimer G,et al. Constructive and induced expression of APO－ 1,a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily,in normal and neoplastic cells. J Exp Med,1993;177:195

　　10 Ungefroren H,Voss M,Jansen M,et al. Human pancreatic adenocarcinomas expression Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas－ mediated apoptosis. Cancer Res,1998;58(15):1741

　　11 Fleck M,Zhou T,Tatsuta T,et al. Fas/Fas ligand signaling during gestational T cell development. J Immunol,1998;158:3766