三氧化二砷诱导人食管癌 Ec109 细胞凋亡伴随 c-myc 基因的降调节
中国医科学院学报2000年第22卷第1期
邓友平 林晨 张雪艳 陈德权 肖培根 吴旻
摘 要：目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对食管癌 Ec109 细胞系的生物学效应及细胞和分子机制。 方法 通过四氮唑(MTT) 还原法检测三氧化二砷(As2O3)对食管癌 Ec109 细胞系存活率的影响 ，从形态观察、流式细胞仪分析、DNA 凝胶电泳、细胞凋亡原位检测(TUNEL)研究三氧化二 砷诱导食管癌 Ec109 细胞凋亡的情况，并以 Western blot 检测基因表达。 结果 Ec109 细胞经 As2O3 处理后，存活率明显降低。光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞 ，在细胞周期 G1 期前有低于2倍体的凋亡峰；DNA 凝胶电泳显示出典型的凋亡特征：DNA 有规律断裂形成的梯状图谱，细胞凋亡原位检测发现 DNA 断裂，Western blot 检测表明 c -myc 基因的表达下降。 结论 As2O3 能诱导人食管癌 Ec109 细胞凋亡，并伴随 c-myc 基因的降调节。
关键词：三氧化二砷 食管癌 Ec109 细胞 细胞凋亡 c-myc 基因
三氧化二砷(As2O3) 是我国传统中药砒石的主要成分。近年来的工作表明， As2O3 用于急性早幼粒白血病 (APL)［1～3］ 治疗具有良好的疗效，且对全反式维甲酸 (ATRA)治疗后复发的患者有效。 As2O3 治疗白血病的基础是诱导细胞发生凋亡［ 4］， 而 ATRA 治疗白血病的基础则是诱导分化，这是 As2O3 对 ATRA 耐药患 者仍有疗效甚至效果更好的原因之一。1990～1992年中国恶性肿瘤死亡抽样调查显示，食管癌分别占我国和世界恶性肿瘤发病的第 5 位和第 7 位，世界上70%的食管癌均发生在我国 ［5］， 目前食管癌 5年生存率还在 30% 以下。本实验以食管癌 Ec109 细胞为模型，研究 As2O3 对其生物学效应及作用机制。
材料和方法
材料 As2O3 购自 Sigma 公司，用生理盐水配成 1 mmol/L 的贮存液，使用前用完全培养基 稀释到所需浓度。
细胞和细胞培养 人食管癌 Ec109 细胞，由本院分子肿瘤学国家重点实验室保存。用 M199 培养基培养。
MTT 还原试验 在 96 孔板中每孔接种 2500 个细胞，培养 1、3、5、7 d后，参考文献［6］方法进行 MT T 实验，用自动酶标检测仪 (Biokinetics Reader, Microplate EL312e M， 美国) 在 540 nm 处检测光吸收值，以(用药组吸光度 A/对照组吸光度 A)×100% 计算细胞的存活率。
细胞形态观察 每瓶接种 1.0×106 个细胞，24 h后用不同浓度的 As2O3 处理，每天用相差显 微镜观察并照相，记录用药组和对照组细胞形态变化。
流式细胞仪检测 参考文献［6］方法进行，收集 As2O3 处理前后的细胞， 70% 冷乙醇固定 24 h， 10 μg/ml RNase A 37℃ 温育 30 min后，加 PI 使其终浓度达 20 μg/ml， 暗处作用 0 .5 h以上。用流式细胞仪(Coulter, Epicus ELITE, ESP, 美国)检测，数据用 Multicy cle 分析软件分析。
DNA 提取和凝胶电泳 按照文献［7］方法略加改进。
细胞凋亡的 TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling) 检测 按细胞凋亡检测试剂盒 (Boehringer Mannheim 公司产)说明书方法进行。
Western blot 分析 提取细胞处理前后的蛋白，用 BCA Protein Assay Kit (Sigma 公司)法定量。 80 μg 蛋白用 10% SDS-PAGE 分离，转移到硝酸纤维素膜 (Bio-Rad 公司)上，按照化学发光试剂盒 (Amersham 公司)说明杂交。
结 果
As2O3 对食管癌 Ec109 细胞存活率的影响 1 μmol/L 以上的 As2O3 可明显降低食管癌 Ec109 细胞的存活率，而且随着浓 度的增加和时间的延长，细胞的存活率逐渐降低，呈现明显的时间和剂量依赖关系(图1)。
图 1 三氧化二砷(As2O3) 对食管癌 Ec109 细胞
存活率的影响
Fig 1 Effect of on the viability of human esophageal cancer Ec109 cells
As2O3 处理食管癌 Ec109 细胞的形态学变化 As2O3 处理食管癌 Ec109 细胞后，在相差显微镜下观察到细胞形态变化十分明显。 5 μmol/L As2O3 处理 1 d的食管癌 Ec109 细胞的形态几乎没有变化；3 d后不少细胞变圆，且细胞数目明显减少，细胞质和染色质浓缩，细胞膜弯曲，并有由核碎裂形成的凋亡小体而显现典型的凋亡细胞形态；5 d后，凋亡细胞数进一步增加，多数细胞脱落而悬浮于细胞培养液中，少数细胞体积增大、膜破裂而呈细胞坏死状(图2)。
图 2 相差显微镜下 As2O3 处理 Ec109 细胞的形态变化
Fig 2 Morphological changes in Ec109 cells exposure to As2O3
A. untreated Ec109 cells (control); B～D. Ec109 cells treated with As 2O3 (5 μmol/L) for 1, 3, 5 days, respectively
流式细胞仪检测结果 不同浓度 As2O3 处理 Ec109 细胞 3 d后，在细胞周期 G1 期前，出现明显的凋亡峰 ； As2O3 2 μmol/L 处理 3 d时，凋亡峰便比较明显，而且凋亡峰值随着浓度的增加 而增加(图3)。
图 3 As2O3 处理的 Ec109 细胞 72 小时 DNA 含量分布的直方图
Fig 3 DNA histograms from flowcytomytric analysis of As2O3
treated Ec109 cells f or 72 hours
AP: represented apoptotic cells
As2O3 处理食管癌 Ec109 细胞提取基因组 DNA 电泳结果 不同浓度的 As2O3 处理食管癌 Ec109 细胞后，基因组 DNA 凝胶电泳显现明显的梯状图谱。用 2 μmol/L As2O3 处理食管癌 Ec109 细胞 48 h，即可呈现梯状电泳带，而用 5 或 10 μmol/L As2O3 处理 Ec109 细胞时，梯状电泳条带更为清晰(图4)。
图 4 As2O3 作用 Ec109 细胞 48 小时提取基因组 DNA “梯状” 电泳图谱
Fig 4 Detection of DNA ladder in a agarose gel after Ec109 cells treated with 1， 2， 5， 10 μmol/L As2O3 for 48 hours
C. Control; DNA marker: M1. DNA/HindⅢ; M2. DNA/HaeⅢ;
1， 2， 5， and 10. As2O3 1， 2， 5， and 10 μmol/L, respectively
细胞凋亡 TUNEL 检测结果 未经 As2O3 处理的食管癌 Ec109 细胞仅呈现红色荧光，而经 5 μmol/L As2O3 处理 3 d的食管癌 Ec109 细胞大部分呈现表明细胞凋亡的绿色或黄绿色荧光。
As2O3 对食管癌 Ec109 细胞 c-myc 基因表达的影响 Western blot 分析发现，经 5 μmol/L As2O3 处理不同时间，食管癌 Ec109 细胞中的 c-myc 蛋白表达受到抑制，且表现为明显的时间依赖关系，到 72 h几乎检测不到 c-myc 基因的表达( 图5)。
图 5 Western blot 检测 As2O3 处理的 Ec109 细胞中 c-myc 蛋 白的表达
Fig 5 Western blot analysis of c-myc gene
expression in As2O3 treated Ec109 cel ls
β-actin： internal control; C. control
讨 论
砷剂是有毒化合物。流行病学研究表明，砷剂是一种致癌剂，可引起皮肤癌、肺癌［ 8］等。但低剂量的三氧化二砷 (As2O3) 作为一种有效的中药，早已载入我国中药的史册。据记载 As2O3 能治疗牛皮癣、梅毒和类风湿关节炎等疾病。当代研究证明，As 2O3 对早幼粒白血病(APL)具有良好的临床疗效。
为了探讨 As2O3 对白血病以外肿瘤的疗效，本研究探讨 As2O3 对食管癌 Ec109 细胞的生物学效应及其机制。实验发现食管癌 Ec109 细胞经 As2O3 处理后，细胞的存 活率明显降低，细胞呈现明显的凋亡形态， 流式细胞仪分析显示 G1 期前出现低 于二倍体的凋亡峰，凝胶电泳检测到 DNA 核小体间整倍断裂的梯状图谱，TUNEL 检测到 DNA 断裂 ，提示 As2O3 能诱导食管癌 Ec109 细胞的凋亡。
细胞凋亡是一种区别于细胞坏死的、主动的、程序化的细胞死亡形式，它在胚胎发生、器官发育、变态反应和保存机体自身稳定过程中发挥着重要的作用［9］。有人认为当细胞生长和细胞死亡的平衡被破坏时，肿瘤就会发生［10］。细胞凋亡为肿瘤治疗提供了 新思路和靶点。本研究证实 As2O3 能明显诱导食管癌 Ec109 细胞凋亡，表明 As2O3 有可能成为通过诱导细胞凋亡而发挥作用的抗食管癌药物。
本实验发现，2 μmol/L As2O3 作用 2 d，即可使食管癌 Ec109 细胞出现典型的 凋亡特征，这十分接近 As2O3 作用于 APL 细胞系 NB4 细胞的剂量(0.25～2 μmol/L )［4］。因为 NB4 细胞体外实验剂量是根据临床用药量推算而来，由此可以推测临床治疗 APL 的 As2O3 剂量，也有可能对食管癌有效。而且食管癌为实体型肿瘤，可采用局部给药以增加肿瘤组织局部的药物浓度，因此有适当提高用药剂量、增加 As2O3 治疗效果的可能性。
c-myc 原癌基因已证明与许多癌症的发生有关［11］，是一个与细胞增殖、分化、转化和凋亡相关的调节子［12］。本研究发现 As2O3 能降低食管癌 Ec109 细胞中 c-myc 基因的表达，这可能是其导致食管癌 Ec109 细胞凋亡的机制之一。
作者简介：邓友平 肖培根 Institute of Medicinal Plant Development, CAMS and PUMC；
林晨 Corresponding author Tel: 01067723793， Fax:01067723793，
E-mail:clin@public.bta.net.cn
作者单位：邓友平（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
林晨（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
张雪艳（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
陈德权（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
肖培根（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
吴旻（中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实 验室， 北京 100021）
参考文献：
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