食管癌及癌旁组织中EGR-1、c-fos、cyclin D1的表达

临床与实验病理学杂志 2000年第3期第16卷 人体病理学

作者：杨焕星　吴名耀　梁英锐

单位：（汕头大学医学院病理学教研室，汕头　515031）

关键词：食管肿瘤；EGR-1；c-fos； cyclin D1

　　摘要　目的：研究EGR-1 、c-fos 、cyclin D1 3种基因mRNA及其相应蛋白在人食管癌癌变过程中的表达水平及其相关性，并探讨其与食管癌的发生、发展及生物学行为的关系。方法：应用原位杂交法检测47例食管鳞状细胞癌及其癌旁、上切缘中3种基因的mRNA、免疫组化SABC法检测蛋白表达水平。结果：3种基因原位杂交、免疫组化阳性表达产物均分别定位于胞浆及胞核中。EGR-1 mRNA 、c-fos mRNA 、cyclin D1 mRNA及蛋白分别在食管粘膜上皮非典型增生和鳞癌中呈高表达。表现为非典型增生粘膜中EGR-1、c-fos表达高，cyclin D1表达低，进展为癌后，EGR-1表达下降，c-fos表达持续，cyclin D1表达则变高；3种基因mRNA与其相应蛋白在各自高表达病变类型中表达具有一致性。结论：食管癌癌变过程各病变类型EGR-1，c-fos，cyclin D1表达不同，癌基因和抑癌基因的相互作用、相互制约将决定食管癌癌变过程的发生、发展及转归。

　　中图分类号　R735.1　文献标识码　A

　　文章编号 1001-7399(2000)03-0184-04

Study on expressions of EGR-1, c-fos and cyclin D1 in human esophageal carcinoma

Yang Huanxing　 Wu Mingyao　 Liang Yingrui

　　（Dept of Pathol , Shantou University Medical College, Shantou　515031）

　　ABSTRACT　Purpose　To study the expressions and correlations of mRNAs and proteins of EGR-1, c-fos and cyclin D1 in human esophageal canceration course,and to probe the relationship between the expression of them in esophageal cancinoma(EC) tissues and the occurrence, development and biology behavior of EC. Methods　In situ hybridization and immunohistochemistry were used respectively to detect mRNAs and proteins in 47 cases of esophageal squamous cell carcinoma and their correspondent para-cancerous mucosae, distal cuts. Results　In situ hybridization of the three genes and immunohistochemistry showed that positive products were all located in the cytoplasms and nuclei. Over expressions of EGR-1 mRNA, c-fos mRNA, cyclin D1 mRNA and their proteins were found in dysplasias and squamous carcinomas. The expressions of EGR-1 and c-fos were high in dysplasia mucosa, cyclin D1 was low, when it be came to cancer, EGR-1 expression decreased, c-fos continued, cyclin D1 increased. The expressions between mRNA and protein of either of three genes were of consistence in their correspondent highest expression lesions. Conclusion　EGR-1, c-fos, cyclin D1 mRNAs and proteins express differently in various kinds of lesions in esophageal canceration course. The transition and development of esophageal canceration course would be determined by the interaction and supression among oncogenes and tumor suppressor genes.

　　KEY WORDS　esophageal neoplasms; EGR-1; c-fos; cyclin D1

　　食管癌系我国高发癌之一，其发生、发展与癌基因和抑癌基因的相互作用的平衡有关。关于食管癌的癌基因和抑癌基因的表达已有一些研究，但尚未见EGR-1mRNA及蛋白表达的报道。我们应用原位杂交和免疫组化方法对47例食管癌、癌旁、切缘粘膜组织进行EGR-1、c-fos、cyclin D1 mRNA和蛋白产物表达的检测，探讨其与食管癌发生发展及生物学行为的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　收集我室1998年3～12月手术切除的新鲜食管癌标本47例（术前均未接受过化疗或放疗），每例标本分别切取癌灶、癌旁粘膜及上切缘粘膜3处组织各一小块。标本经Carnoy液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色。

　　1.2 方法

　　1.2.1　原位杂交　人pAC-hEGR-1质粒由美国宾州大学医学院病理系John G Monroe博士惠赠，获得后进行质粒扩增、提取、鉴定，回收DNA，随机引物法地高辛标记 EGR-1探针；c-fos、cyclin D1探针均为Boster公司产品。检测mRNA方法按试剂盒说明书并稍加改进进行。EGR-1阳性对照用人乳腺正常组织和小鼠脑组织，c-fos 、cyclin D1阳性对照用Boster公司随配的阳性对照片；阴性对照以不含探针的杂交液替代探针混合液及杂交前RNA酶消化对照(10 mg/L)。

　　1.2.2　免疫组化　EGR-1、c-fos兔多克隆抗体均为Santa Cruz公司产品，cyclin D1鼠单克隆抗体为Calbiochem公司产品。采用 SABC法检测蛋白，方法按试剂说明书进行。DAB显色。阳性对照片同杂交，以PBS替代一抗作阴性对照。

　　1.3　结果判断　细胞浆着棕黄色为EGR-1、c-fos、cyclin D1 mRNA原位杂交阳性，细胞核着棕黄色为免疫组化阳性，阳性细胞占全部肿瘤细胞的比例0（-），＜25%（+），25%～75%（）, ＞75%（)。

　　1.4　统计学方法　χ²检验和确切概率法。

　　2　结果

　　2.1　原位杂交和免疫组化的定位及阳性率　原位杂交和免疫组化染色阳性物质呈浅黄色到深棕黄色，细颗粒状，分别位于胞浆和胞核内（图1～4），EGR-1 mRNA及蛋白多数在非典型增生中表达、c-fos mRNA及蛋白在非典型增生粘膜上皮及鳞癌中表达较高，而cyclin D1 mRNA及蛋白则多在鳞癌中表达。非典型增生粘膜中EGR-1、c-fos表达高，cyclin D1表达低；进展为癌后，EGR-1表达下降，c-fos表达仍高，cyclin D1表达则变高。见表1。

　　2.2　c-fos、cyclin D1 mRNA及蛋白表达阳性程度与食管癌分化程度的关系　3种基因mRNA 与蛋白，其中EGR-1在癌组织中表达很低，余2种基因在癌组织中表达高，但在不同分化的癌组织中表达阳性程度不同。见表2。

　　2.3　c-fos、cyclin D1 mRNA及蛋白的阳性表达与食管癌淋巴结转移的关系　按不同转移状态将食管癌分为两组，各组食管癌c-fos、cyclin D1 mRNA及蛋白的表达与淋巴结转移的关系见表3。

图1　食管正常粘膜上皮，EGR-1 mRNA原位杂交阳性,阳性细胞位于基底层。ISH×200

2　食管浸润性鳞癌（Ⅱ级），EGR-1 mRNA原位杂交阳性,阳性细胞位于癌巢中。ISH×400

3　食管鳞癌（Ⅰ级），c-fos免疫组化阳性,阳性细胞分布于癌巢周边。SABC×200

4　食管鳞癌（Ⅲ级），cyclin D1 mRNA原位杂交阳性,阳性细胞位于癌巢中。ISH×200

表1　癌变过程中各病变类型EGR-1、c-fos 、cyclin D1 mRNA及蛋白表达的情况

　　经校正χ²检验及确切概率法, EGR-1 mRNA与蛋白及c-fos mRNA与蛋白在癌前病变、c-fos mRNA及蛋白与cyclin D1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均具有极高度相关（P＜0.01）

表2　c-fos mRNA及蛋白、cyclin D1 mRNA及蛋白在不同级别食管癌组织中的表达

组　别	n	c-fos								cyclin D1
		原位杂交阳性程度				免疫组化阳性程度				原位杂交阳性程度				免疫组化阳性程度
		-	+			-	+			-	+			-	+
鳞癌Ⅰ级	16	9	3	2	2	4	3	3	6	9	4	3	0	9	3	4	0
鳞癌Ⅱ级	23	14	4	4	1	11	2	4	6	11	5	5	2	14	4	4	1
鳞癌Ⅲ级	8	4	0	1	3	7	1	0	0	3	0	1	4*	4	0	1	3*

　　鳞癌Ⅲ级与鳞癌Ⅰ、Ⅱ级比较， ^*cyclin D1（P＜0.05）

表3　c-fos、cyclin D1 mRNA及蛋白在食管癌组织中的

　　表达与淋巴结转移的关系

　　3　讨论

　　EGR-1是新近确定的一种抑癌基因,为即刻早期基因家族中的一种。Sukhatme等^〔1〕应用原位杂交技术发现，EGR-1基因位于人5q23-31，其蛋白产物是一含有3个锌指结构的转录因子，能与DNA某区段结合，诱发附近若干基因转录变化，从而抑制细胞生长，EGR-1还能作用于细胞周期G₀～G₁期，起调节细胞生长和分化的作用，使细胞不过度生长。其在正常、非癌组织或非恶性细胞中呈高表达，而在癌组织及恶性细胞中表达降低^〔2～6〕，这些均表明其与肿瘤的发生发展有一定关系。

　　应用原位杂交和免疫组化方法对食管癌癌变过程各阶段组织进行检测，发现EGR-1 mRNA和蛋白在非典型增生上皮中表达最高，阳性率分别为62.1%和48.3%, 两者表达具有一致性，同时EGR-1 mRNA及蛋白在食管正常上皮、单纯性增生上皮以及癌组织也有表达，但均不及非典型增生上皮高，差异有极显著性。

　　c-fos原癌基因也是即刻早期基因中的一种，其蛋白产物是一转录因子； 而cyclin D1则是周期素中的一种，在G₁期合成，与CDK2、CDK4和CDK5形成复合物，与细胞周期的控制密切相关。本文研究发现c-fos mRNA及蛋白在食管正常上皮及单纯性增生上皮中表达率很低，其主要在非典型增生粘膜上皮及癌组织中表达，与一些文献报道相似。从c-fos表达情况看，其表达异常可能是食管癌发生过程中的一个较早的分子事件，其表达水平将在一定程度上决定病变的发展及转归。cyclin D1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达高，以低分化鳞癌中表达的阳性程度较强，这可能是低分化鳞癌恶性度较高的原因之一。cyclin D1过表达可能是反映食管癌生物学行为的一个有用的指标，即与食管癌病人的不良预后有关，对没有淋巴结转移的患者，cyclin D1过表达可以作为指导临床上手术后采取合理措施的依据。

　　食管癌的发生发展是一种癌基因与抑癌基因的 作用与制约的过程，其相互关系将决定食管癌的发生和发展。食管粘膜上皮从单纯性增生、非典型增生进展为癌往往有一个癌基因表达增加、抑癌基因表达减少的过程。我们的研究发现，在食管粘膜上皮从癌前病变发展为癌的过程中有EGR-1表达的减少、c-fos的持续表达及cyclin D1表达的增多；EGR-1作用的下降及c-fos、cyclin D1作用的加强，使得食管粘膜上皮基底层细胞细胞周期调控异常，细胞增殖现象明显，细胞分化异常，导致食管癌的发生。至于这些基因在食管癌的发生发展过程中的作用机制，尚有待进一步研究。

　　基金项目：国家自然科学基金资助（No 39670298）

　　作者简介：杨焕星，男，28岁，硕士研究生。研究方向：肿瘤病理

　　参考文献

　　1，Sukhatme VP, Cao XM, Chang LC et al. A zinc-finger encoding gene coregulated with c-fos during growth and differentiation and after cellular depolarization . Cell, 1988;53:37～43

　　2，Levin WJ, Press MF, Gaynor RB et al. Expression patterns of immediate early transcription factors in human non-small cell lung cancer. Oncogene, 1995;11:1261～1269

　　3，Huang RP, Fan Y, De Belle I et al. Decreased EGR-1 expression in human,mouse and rat mammary cells and tissues correlates with tumor formation. Int J Cancer, 1997;72:102～109

　　4，Huang RP, Darland T, Okamura D et al. Suppression of v-sis dependent transformation by the transcription factor, EGR-1. Oncogene, 1994;9(5):1367～1377

　　5，Huang RP, Liu C, Fan Y et al. EGR-1 negatively regulates human tumor cell growth via the DNA-binding domain. Cancer Res, 1995;55:5054～5062

　　6，Liu C, Adamson E, Mercola D. Transcription factor EGR-1 suppresses the growth and transformation of human HT-1080 fibrosarcoma cells by induction of transforming growth factor β1. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:11831～11836

收稿日期：1999-07-05

　　修回日期：1999-09-10