食管癌组织多种肿瘤抑制基因微卫星多态位点的杂合丢失和不稳定

癌症 1999年第4期第18卷 快速报道

作者：吴孔明　王明荣　王瑞林　韩亚玲　蔡岩　徐昕　晏梅　孙燕　吴旻

单位：吴孔明　王瑞林　晏梅　河南医科大学附一院肿瘤科(郑州市，450052)；王明荣　韩亚玲　蔡岩　徐昕　吴旻　中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞生物室(北京，100021)；孙燕　中国医学科学院肿瘤医院内科(北京，100021)通讯作者

关键词：食管癌；杂合丢失；微卫星DNA；抑癌基因

　　【摘要】目的：研究p53，p16，Rb，DCC，APC等多种已知抑癌基因在食管癌组织中的缺失及与临床病理的关系。方法：采用PCR银染技术，检测高发区36例配对的食管癌标本14个微卫星DNA多态位点的杂合丢失和不稳定性。结果：分别与p53，p16及Rb连锁的D17S261，D9S162、D9S171、IFNA和D13S170均有高频率的杂合丢失(＞25％)；两个以上的位点异常者占86％，pTNMⅢ期患者微卫星DNA多态位点异常的频率显著高于Ⅱ期患者(P＜0.01)。结论：同一病例有多个微卫星DNA多态位点异常提示食管上皮癌变涉及多个抑癌变涉及多个抑癌基因的失活。

　　中图分类号：R735.1　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)04－0361－03

The loss of heterozygosity and microsatellite DNA instability of esophageal carcinomas in multiple tumor suppressor genes polymorphous sites

Wu Kong-ming， WANG Ming-rong, wANG Rui-lin, etal.

　　【Abstract】Objective：To study the deletion frequency of tumor suppressor genes p53, p16, Rb, DCC, APC, fHIT, PTEN in esophageal carcinoma (EC)and their relationship to clinic-pathological characteristics.Method：Using PCR-silver staining technique, the loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MSI) among 14 microsatellite DNA polymor phicmarkers were examinedin 36 matched human esophageal cancers and adjacent normal mucosal tissues.Rsults：High frequency of LOH (＞25％) was found in D17S261， D9S162， D9S171， IFNA and D13S170, which were respectively linked to p53, p16 and Rbgenes. Eighty-six percent (86％) of patients had 2 or more aberrant sites, the tumors of pTNM Ⅲ showed more abnormal sites than those of pTNM Ⅱ.Conclusion：Multiple microsatellite DNA abnormality in the same tissues suggested that more than one suppressor gene was deleted during the carcinogeneses of esophageal epithelia.

　　Key words：Esophageal cancer; Loss of heterozygosity; microsatellite DNA;Tumor suppresorgene

　　抑癌基因在细胞周期的调控、维持细胞稳定方面起重要作用，当抑癌基因某一等位位点缺失或突变时，将导致机体的易感性增加。分子、细胞遗传学研究表明食管癌细胞系及食管癌组织均存在染色体改变及染色体特异部位的杂合丢失和不稳定；同时，PCR扩增，测序及分子杂交技术发现食管癌发生、发展过程中p53、p16、RB、DCC、APC等多种抑癌基因的异常^[1]。利用微卫星多态位点与抑癌基因紧密连锁的关系，本文检测高发区36例配对的食管癌组织p53、p16、RB、DCC、APC、FHIT、P-TEN相邻的14个微卫星多态位点的杂合丢失和不稳定性，以探讨多种已知肿瘤抑制基因在食管癌发生、发展中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料

　　36例配对的食管癌标本取自食管癌高发区河南安阳肿瘤医院，其中，女性10例，男性26例；年龄43～72岁。食管鳞癌35例，腺癌1例。分化程度：高分化12例，中分化11例，低分化6例，分化不明7例。TNM分期：T₂N0M₀5例，T₂N₁M₀7例，T₃N₀M₀9例，T₃N₁M₀15例。

　　1.2　DNA的提取、PCR引物及反应条件

　　手术切除的肿瘤标本及切端正常粘膜组织(病理报告无癌)，常规蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇抽提DNA。13对引物购自Research geneticsInc.另有1对引物由上海生工生物工程有限公司合成。20μl反应体系中加入基因组DNA50～100ng，上下游引物各10 pmol，10×PCR缓冲液2μl，dNTPs200 μmol/L，Taq酶1U。经95℃变性5分钟后，94℃30秒、54～60℃60秒、72℃60秒，35个循环，最后72℃延伸5分钟。

　　1.3　聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及结果观察

　　将PCR产物与等体积甲酰胺上样缓冲液混合后95℃变性5分钟。6％变性聚丙烯酰胺(含7mol/L尿素)550V电泳4小时。按文献报告的方法染色^[2]。

　　结果判定：肿瘤组织与相应的正常组织比较，若肿瘤的某一等位基因条带消失或相对密度减少50％以上，则记录为杂合丢失(LOH)；若出现等位基因条带的增多或位置的改变，则评价为微卫星不稳定(MSI)；若等位基因为纯合子，记为无信息(UI)。

　　2　结果

　　2.1　微卫星DNA多态位点LOH和MSI

　　不同位点LOH和MSI频率差异显著(见表1)。D9S162，D9S747，IFNA，D13S170及D17S261多态位点LOH较高(＞25％)，D10S2491，D2S170，D3S966等位点丢失频率较低(＜15%)。MSI频率为8.0%～19.3%，大部分位以LOH为主，LOH/MSI=1.9(见图1)。

图1　部分微卫星多态位点的杂合丢失和不稳定：N：手术切端正常食管粘膜，T：癌组织，LOH：杂合丢失，MSI：微卫星不稳定。

表1　食管癌组织多种肿瘤抑制基因微卫星多态位点的杂合丢失和不稳定

　　2.2　微卫星DNA多态位点异常与临床病理的关系

　　36例食管癌组织中，所有位点均正常1例(2.7％)，1个位点异常4例(11.1％)，2个位点异常6例(16.6％)，3个位点异常2例(5.5％)，4个以上位点异常23例(63.8％)。按肿瘤大小分类，T₂期12例，微卫星DNA多态位点异常＜3个者8例，＞4个者4例；T₃期24例，微卫星DNA多态位点异常＜3个者5例，＞4个者19例，经x²检验，有统计学差异(P＜3个者7例＞4个者7例；有淋巴结转移者22例，＜3个者6例＞4个者16例。高分化癌12例，＜3个位点异常7例＞4个者5例；中分化癌11例，＜3个者5例，＞4个者6例；低分化癌6例，均＞3位点异常，但均无统计学差异。3　讨论

　　90年代发现散布于人类染色体的微卫星DNA具有高度多态性、信息量大、检测方便、所需样品少、定位精确，因而被广泛地用于个体鉴定、遗传病的连锁分析及致病基因的定位克隆。李卫东等根据细胞遗传学资料，选择24个微卫星DNA多态位点，检测来自食管癌高发区山西阳泉和低发区北京的散发标本，发现相当于染色体9p22-23、3p14.2、2p22、3p24-26、11q13.1等部位的微卫星DNA有高频率的杂合丢失(＞20％)^[3]，位点特异性的微卫星DNALOH和MSI可能与食管癌的发生、发展有关。

　　本文结果显示9号染色体上与p16连锁的四个多态位点均有很高的丢失频率，这与既往研究结果所显示的p16在食管癌细胞系及食管癌组织较高频率的突变、缺失及表达异常相一致^[4]。p53异常是人类肿瘤最常见的遗传改变，Wagata等证实食管癌组织17pLOH占50％，且p53突变与17pLOH紧密相关^[5]。本文D17S261LOH频率为25％，低于上述报告，这与所选择的多态标记探针和组织标本不同有关。Rb基因通过磷酸化和脱磷酸化调节细胞周期，Rb基因失活使细胞G₁期调控点异常，细胞过度增殖。李华川等用Northernblot检测中国食管癌高发区标本，Rb丢失率33.3％^[6]，本文D13S170丢失率35％，两种方法结果相同。

　　APC，DCC分别为家族性结肠腺瘤样息肉和结肠癌的易感基因，近年来研究表明该基因异常与食管癌发生、发展也有关。Maesawa等用PCR-SSCP及RFLP检测49例食管鳞癌组织，发现APC位点LOH率为55％^[7]。Miyake等报告DCC杂合丢失率23％(10/44)，仅见于中、低分化鳞癌，多伴有淋巴结转移^[8]。本文APC，DCC微卫星多态位点LOH率分别为18.8％、20％，稍低于上述报告，但同李卫东等的结果一致^[4]。

　　3p缺失在肺癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤中常见，Wang等发现食管癌组织3p13LOH率为17％，3p14LOH频率为28％；高发区食管癌组织3p23丢失频率高，低发区3p14.2丢失频率高^[9]。本研究所用的D3S1285位于3p13-14，35例食管癌高发区标本LOH频率为16.6％，支持Wang等的结论。1997年Li等从胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌纯合缺失区域10q23分离、克隆到PTEN/MMAC-1基因，其功能可能与细胞粘附、细胞间信号传导有关。本文选用的多态位点D10S541紧邻PTEN/MMAC-1基因的着丝粒侧，D10S2491位于PTEN/MMAC-1基因内，但两者LOH率均低于15％，提示PTEN/MMAC-1基因丢失在食管癌中可能不常见，这与临床所见食管癌较晚发生广泛转移相一致。D2S170位于2p16,D3S966位于3p21.3,分别与人修复基因hMSH2、hMLH1相邻。D2S170异常者8例(27.5％)D3S966异常者7例(24％)，2个位点均异常者3例，修复基因位点异常者其它位点发生LOH、MSI的频率有增加的趋势，提示修复基因异常可能与食管癌发生有关。

　　利用微卫星DNA进行辅助诊断的报告较少。MaoLi等用双盲法比较了微卫星标志检测尿脱落细胞和常规病理诊断膀胱癌临床结果^[10]，认为微卫星标志是筛选膀胱癌的有用方法。本文35例食管癌组织中，14个微卫星标志任一位点异常者34例(97％)，若按2个以上位点异常作为诊断标准，阳性率为87％，如检测高频率改变的6个微卫星标志，阳性率为70％。

　　基金项目：本课题受863重大项目基金(Z19－02－01－03)、九五攻关项目基金(96－906－01－22)和河南省重大项目基金(971200101)资助

　　参考文献

　　1 吴旻，肖枫，王秀琴.食管癌细胞和分子遗传学研究[J].中华肿瘤杂志，1996，18(1)：73～78.

　　2 朱丹，王亮，吴旻.应用PCR-SSCP银染技术检测食管癌p53基因点突变[J].中华医学遗传学杂志，1994，11：354～355.

　　3 李卫东，王亮，王秀琴，等.食管癌组织染色体位点特异性的杂合性丢失和微卫星DNA序列不稳定[J].中华医学遗传学杂志，1996，13(4)：194～197.

　　4 金顺钱，彭琼，陆士新，等.食管癌组织中MST1/p16基因的缺失[J].中华肿瘤杂志，1998，20(1)：9～11.

　　5 Wagata T,Shibagaki I, Imamura M, et al. Loss of 17p, mutation of the p53 gene, and over expression of p53 protein in esophageal squamous cell carcinoma[J]. cancerRes, 1993, 53： 846～850.

　　6 李华川， 陆士新， 姜伟， 等. 食管癌组织中抗癌基因Rb的研究[J].中华肿瘤杂志， 1990， 12： 121～123.

　　7 Maesawa C, Tamura G, Suzuki Y, et al. Aberation of tumor suppressor gene (p53, apc, mcc, and Rb) in esophageal squamous-cell carcinoma [J] .Int J Cancer, 1994,57 (1)：21～25.

　　8 Miyake S, Nagai K, Yoshino K, et al. Point mutations and allelic detection of tumor suppessor gene DCC in human esophageal squamous cell carcinomas and their relation to metastasis[J]. Cancer Res, 1994, 54：3007～3010.

　　9 Wang L, Li WD, Wang XQ, et al. Genetic alterations on chromosomes 3 and 9 of esophageal canecer tissue from China[J]. Oncogene, 1996,12：699～703.

　　10 Mao L, Schoenberg MP, Scicchitano M, et al. Molecular detection of primary bladder cancer by microsatellite analysis[J]. Science, 1996,271：659～662.

收稿日期：1999－01－05；修回日期：1999－04－20