平阳霉素诱导人食管癌细胞EC8712凋亡的研究

癌症 1999年第6期第19卷 基础研究

作者：彭心昭,沈忠英,黎妙娟,蔡唯隹,朴英杰

单位：彭心昭,朴英杰　第一军医大学中心实验室电镜室(广州,510515)；沈忠英,黎妙娟,蔡唯隹　汕头大学医学院病理学系(汕头,515031)

关键词：食管肿瘤；平阳霉素；凋亡

　　【摘要】目的：以平阳霉素诱导食管癌细胞凋亡,并探索药物浓度与诱导凋亡之间的关系。材料与方法：应用电镜、DNA电泳、TUNEL、荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等手段，观察食管癌细胞在不同浓度平阳霉素作用不同时间后的变化特征及诱导凋亡之作用。结果：细胞形态学及DNA水平的变化均证实靶细胞发生了凋亡，但较大浓度较长时间的平阳霉素作用可致其坏死；平阳霉素对EC8712凋亡的诱导效率呈浓度、时间依赖性增强。结论：一定浓度平阳霉素作用一定的时间可以诱导食管癌细胞株EC8712发生凋亡。诱导癌细胞凋亡可能是平阳霉素化疗作用的重要机制。临床化疗时可根据量效关系合理用药以诱导肿瘤细胞达到最大的凋亡率,而又不致其坏死、发生毒副作用。

　　中图分类号：R735.1　　文献标识码：A　　文章编号：1000-467X（1999）06-0657-04

Pingyangmycin- induced apoptosis in human esophageal

　　carcinoma cells EC8712

PENG Xinz- hao¹, SHEN Zhong- ying²,LI Miao-juan²,et al.

　　1.Central Laboratory,First Military Medical University,Guangzhou 510515, P.R.China 2.Department of Pathology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,P.R.China

　　【Abstract】 Objectives：Pingyangmycin was used in vitro to induce apoptosis in human esophageal carcinoma (EC) cell line EC8712 and the concentration- effect relationship was studied. Methods： Transmission electron microscopy (TEM), electrophoresis of DNA, terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick end- labeling (TUNEL), fluorescence microscopy and confocal laser scanning microscopy (CLSM) were used to analyse the characteristic cellular changes. Results： Pingyangmycin used in proper concentration may induce apoptosis in EC8712, but higher concentration of the drug can lead necrosis of the cells. Pingyangmycin- induced apoptosis of EC8712 cells is in a concentration-dependent manner. Conclusions： Apoptosis of EC8712 can be induced by pingyangmycin within proper concentration after a long enough time. Apoptosis induction may be the major mechanism in chemotherapy of esophageal cancer with pingyangmycin. It is suggested that pingyangmycin should be used rationally according to the concentration-effect relationship in clinical chemotherapy in order to induce the tumor cells to maximal apoptotic rate without necrosis and toxic or side effects.

　　Key words：Esophageal neoplasm； Apoptosis； Pingyangmycin

　　平阳霉素(pingyangmycin)是国产常用食管癌化疗药之一,其抗癌作用是否通过其诱导癌细胞凋亡?目前国内外尚未见这方面的报道。本实验以食管癌细胞为靶细胞,观察其在平阳霉素作用后的形态等特征,探讨平阳霉素的抗癌机制是否与诱导凋亡有关，并观察其浓度、时、效之间的关系,为平阳霉素在食管癌治疗应用中的改进提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1癌细胞及培养

　　人食管癌细胞株EC8712(高分化鳞癌细胞株,由中国医科院分子肿瘤学实验室构建)生长于Medium199培养液中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中。待细胞进入指数生长期后开始加药。

　　1．2药品及细胞处理

　　平阳霉素为河北制药厂产品(批号：950287)，用生理盐水溶解。细胞分别接种于放有小玻璃盖片的培养孔板中及数个培养瓶中,加入不同浓度的平阳霉素,分别为10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml；分别于药物作用后的2，6，24，48小时收获细胞检查。对照组：药物为零剂量,只加生理盐水。

　　1．3荧光染色

　　分别取出不同浓度不同时间作用的生长于盖片上的培养细胞,滴加：(1)Hoechst33342(Sigma)；(2)PI(Sigma)。置紫外激发的荧光显微镜下观察。

　　1．4激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察

　　平阳霉素40μg/ml作用24小时的培养细胞盖片,AO（Sigma）37℃避光染色。主要实验参数为：显微镜物镜：100X1.30oil；激发光：488nm；Pinhole：225um；扫描激光强度：15％；PMT1：26.6％；沿Z轴光切片数：20；LCSM型号：ACASUltima312(Meridian,USA)；用ACASUltima312三维重建软件显示图像。

　　1．5TUNEL染色(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling)

　　不加药物的对照组和经不同时间不同浓度药物作用后的培养细胞分别参照文献^〔1〕的方法进行TUNEL染色。阴性对照：上述步骤中以PBS代替TdT作替代对照。阳性对照：相应的培养细胞盖片用DNA酶I反应液处理后再进行TUNEL。

　　1．6电镜观察

　　主要步骤：经平阳霉素80μg/ml作用48小时、100μg/ml作用60小时后的培养瓶中细胞,分别行胰酶消化、离心收集细胞,2.5％戊二醛4℃固定,2％锇酸后固定,梯度乙醇脱水、PDAP浸透、包埋、聚合、超薄切片、柠檬酸铅染色后置透射电镜(日立H300型)下观察。

　　1．7DNA提取与电泳

　　将对照组及平阳霉素80μg/ml作用48小时组的培养瓶中细胞经胰酶消化后离心收集，提取DNA，琼脂糖凝胶电泳，具体步骤按文献^〔2〕采用的方法进行。

　　1．8细胞凋亡定量法

　　每张TUNEL染色的盖片随机选择5个有代表性的400X高倍视野分别观察500个细胞(每视野100个),平均计算每100个细胞内的阳性细胞数作为细胞凋亡指数(apoptoticindex,AI)。

　　2结果

　　2．1细胞形态改变

　　2．1．1　荧光显微镜观察：对照组食管癌细胞核呈类圆形,边界清,染色质均匀细沙样分布,呈均匀浅蓝染色；而用药组的癌细胞可见有核变小、固缩、或致密粗块状改变,荧光强度增强。随药物浓度加大、作用时间延长,具凋亡形态的细胞进一步增多,并可见核碎裂成大小不等的碎片。少量的死细胞呈红染。很多细胞具有凋亡之形态改变、但对PI拒染而仍呈蓝色。

　　2．1．2　CLSM观察：细胞浆与核仁呈红色荧光,胞核呈黄色荧光。共观察了44个细胞,除有7个细胞形态较正常外,其余37个或为凋亡小体或为有凋亡形态改变的凋亡细胞。凋亡细胞胞体缩小,核染色质聚集致密,胞浆浓缩,荧光强度强,或有碎裂核或有凋亡小体形成(图1)。

图1　CLSM下见凋亡细胞胞体缩小,染色质致密,胞浆浓缩；或有核碎裂、凋亡小体形成

　　2．1．3　TUNEL染色：染色阳性物质呈棕黄色,主要位于核内。多数TUNEL阳性的凋亡细胞的胞体胞核缩小,核仁消失,有的呈核碎裂状或形成凋亡小体(图2)。也有很多胞体胞核体积、形态基本正常、核仁未消失的阳性染色细胞。未加药组的TUNEL见有个别阳性细胞。阴性对照均未见阳性染色的胞核。用DNaseI处理的TUNEL阳性对照显示整个玻片为均匀一致的核阳性染色。

图2　凋亡细胞呈棕黄色,胞体缩小,核固缩(10μg/ml,6小时组)TUNEL×400

　　2．1．4　电镜观查：于80μg/ml、48小时组见有单个散在的凋亡细胞,外形不规则,细胞核可见核膜皱缩,染色质固缩,成块状,境界分明,聚于核膜下；有的核呈环形,有核膜包绕；有的核变小,变圆,核固缩,电子密度加大(图3)。但100μg/ml、60小时组见有很多细胞核染色质减少、分布不均、边界不清,细胞器结构破坏,胞膜破裂等细胞坏死性改变(图4)。

图3　单个散在的凋亡细胞染色质固缩聚于核膜下呈环形,境界分明,

　　有完整的核膜包绕(TEM×7000)

图4　图中见有一群细胞呈坏死改变：染色质分布不均,边界不清;

　　细胞器、胞膜破裂溶解(TEM×3000)

　　2．2凋亡与药物浓度、作用时间的关系

　　经TUNEL染色后观察肿瘤细胞AI与药物浓度、作用时间的关系：可见AI随药物浓度提高及作用时间延长而增高(见表1)。

表1　细胞凋亡指数（AI）与平阳霉素作用浓度、作用时间的关系

浓度(μg/ml)	细胞凋亡指数（±s）
	2小时	6小时	24小时	48小时
0	0.41±0.54	1.22±0.83	0.64±0.89	2.37±1.16
10	12.58±2.82	16.04±4.35	56.76±12.24	66.43±6.47
20	9.23±3.04	11.82±3.28	80.44±7.95	100.00±0.00
40	18.02±5.09	83.21±8.72	90.58±3.91	100.00±0.00
80	67.17±6.24	91.42±2.45	98.82±1.78	100.00±0.00

　　经用双向方差分析：时间组间之差别有显著性意义(P＜0.05)；浓度组间之差别有非常显著性意义(P＜0.01)。

　　2.3凋亡细胞的DNA片段电泳

　　对照组细胞之DNA为大分子,电泳速度极慢,停留在加样孔附近不远处；平阳霉素80μg/ml作用48小时之细胞DNA电泳出现了“梯带”(图5)。

图5　DNA琼脂糖凝胶电泳.1泳道:pGEM-7Zf(＋)/HaeⅢmarkers;2泳道:平阳霉素浓度为零的对照组;3泳道:平阳霉素80μg/ml处理组

　　3讨论

　　国产平阳霉素是常用的食管癌化疗药之一,其抗癌疗效是肯定的。平阳霉素的抗肿瘤机制主要是破坏DNA,造成DNA单链断裂、双链断裂及染色质高级结构的改变^〔3〕。但是,现尚不清楚平阳霉素作用于肿瘤细胞是否可诱导其凋亡。

　　本实验采用Hoechst-PI染色荧光显微镜观察，其特点之一是可以区别活细胞和死细胞。本实验可见随药物浓度加大、作用时间延长,具凋亡形态的细胞逐渐增多；还有很多癌细胞虽然发生了凋亡之形态改变,但还是对PI拒染,这说明其细胞膜系统仍然完整,细胞仍存活,这也是早期凋亡细胞与坏死细胞的重要区别之一。

　　CLSM观察时所用的荧光染料AO(acridineorange)能实现对细胞DNA/RNA黄红双荧光染色。AO能进入胞膜正常的细胞,胞膜正常的凋亡细胞因核DNA浓缩致密,并切割成大小不等、185bp倍数的片段,所以呈致密浓染荧光亢进的颗粒状或块状。本实验在CLSM观察下可见有较典型的凋亡细胞及凋亡小体。

　　要确定细胞的死亡是由凋亡所致而不是由坏死所致,最好是观察有无染色质的明显结构变化,这些变化包括广泛的染色质凝聚和DNA断裂的片段化^〔4〕。凋亡细胞原位TUNEL法能在DNA水平上原位标记DNA断裂点,确定凋亡细胞的位置与数量。本实验除见有多量形态改变较典型的TUNEL阳性凋亡细胞外，另见有很多胞体胞核体积、形态基本正常、核仁未消失的细胞TUNEL呈阳性染色。这说明TUNEL能在先于形态学表现之前早期发现凋亡细胞,故TUNEL法计数凋亡细胞较客观,其结果也高于一般染色法，例如H.E.染色计数。本实验还用TUNEL定量分析了不同浓度不同作用时间的平阳霉素诱导EC8712凋亡的效果。可以看出,平阳霉素对EC8712凋亡的诱导效率呈浓度、时间依赖性增强,提示以一定浓度的平阳霉素作用一定时间以增强诱导凋亡,是临床要获得较好疗效的内在基础。

　　DNA电泳出现特殊的阶梯状条带改变是凋亡细胞重要生化标志。本实验在平阳霉素80μg/ml作用48小时之培养细胞的DNA电泳时出现了“梯带”。这也证实平阳霉素诱导EC8712细胞发生了凋亡。

　　电镜下的凋亡形态应该是凋亡形态学方面一个重要的表现。本实验80μg/ml、48小时组中见有呈凋亡之形态改变的细胞；而100μg/ml、60小时组中大部分细胞呈现核、浆溶解之坏死性改变,其原因可能是药物浓度较大、作用时间较长而致细胞坏死或凋亡细胞发生了继发性坏死。有研究报道：抗癌药物诱导的细胞凋亡与药物浓度有关,低浓度时引起凋亡,而高浓度时则可引起坏死^〔5〕。也有可能开始发生的是凋亡,而在凋亡的晚期凋亡细胞可发生膜受损、继发性坏死（secondary necrosis)。继发性坏死只在体外实验可以观察到；在体内,凋亡细胞在胞膜受损之前即被邻近组织吞噬,不引起任何炎症反应^〔6〕。

　　综合以上几种检测结果,我们认为平阳霉素导致的EC8712细胞的死亡可以是以凋亡形式及坏死形式发生的,一定浓度平阳霉素作用一定的时间可诱导食管癌细胞株EC8712发生凋亡,但高浓度、长时间可致其坏死。诱导癌细胞凋亡可能是平阳霉素化疗作用的重要机制。临床化疗时可根据量效关系合理用药以诱导肿瘤细胞达到最大的凋亡率,而又不致其坏死发生毒副作用。

　　〔参考文献〕

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　　〔6〕Green DR,Bissonnette RP,Cotter TG.Important Advance in Oncology〔M〕.Philadelphia：Lippincott Company.1994：37.

收稿日期：1999－01－19;修回日期：1999－03－23