细胞周期蛋白cyclin D1、CDK4在食管癌中的表达及其意义
癌症 2000年第1期第19卷 基础研究
作者：吴晓华 徐小虎 沈忠英 祝家镇
单位：吴晓华 徐小虎（汕头大学医学院法医研究所）；沈忠英（病理教研室，广东汕头515031）；祝家镇（中山医科大学法医系法医病理教研室，广东广州510089）
关键词：食管肿瘤；cyclin D1；CDK4；免疫组化
摘 要：目的：获得食管癌发生过程中调节G1细胞周期各种因子的作用。方法：采用抗cyclin D1和CDK4的单克隆抗体对10例正常食管和50例食管鳞状上皮癌标本进行免疫组织化学染色。结果：cyclin D1和CDK4在正常食管上皮呈现较低水平的表达，在食管鳞状上皮癌中则过表达。27/50食管鳞状上皮癌cyclin D1染色阳性，其中8例强阳性，12例中等程度阳性，7例弱阳性，27例cyclin D1阳性标本中16例伴有淋巴结转移；26/50为CDK4阳性，12例只表达CDK4，11例只表达cyclin D1，14例既表达cyclin D1又表达CDK4，另有13例既不表达cyclin D1又不表达CDK4。我们在相应的癌旁组织中亦发现cyclin D1和CDK4的过表达。结论：cyclin D1和CDK4的过表达可能参与食管癌的发生，两者的表达增加与食管癌的分化程度相关;cyclin D1的异常可能是食管癌形成过程中较早的分子事件;cyclin D1的过表达在食管癌淋巴结转移标本中的频现提示cyclin D1不仅促进细胞的增殖，而且还可能活化某些细胞亚群，使之出现转移倾向;食管癌中既不表达cyclin D1又不表达CDK4的事实说明可能存在其它调节食管癌进程的机制。
分类号：R735.1 文献标识码：A
文章编号：1000－467X(2000)01－0023－04
Expression of cell-cycle regulators cyclin D1 and CDK4
in esophageal squamous cell carcinoma
WU Xiao-hua XU Xiao-hu SHEN Zhong-ying
Department of Forensic Pathology, Δ Department of Pathology,
Shantou University Medical College, Shantou 515031, P.R.China
Abstract：Objective：To obtain further information about the role of some factors regulating the G1 cell cycle in the development of esophageal squamous cell carcinoma (ESC).Methods：A total of ten normal esophageal epithelia and 50 ESC samples were stained immunohistochemically using monoclonal antibodies against cyclin D1 and CDK4.Results：cyclin D1 and CDK4 showed low expression in normal esophageal epithelium while overexpression in ESC. Twenty-seven out of fifty cases of ESC showed positive reactivity in cyclin D1 staining, 8 of them were extensive positive, 12 moderate positive and 7 weak positive. Sixteen out of 27 cyclin D1 positive ESC samples were from pafients with lymphomatic metastasis. CDK4 positive cells were found in 26/50 ESC. Twelve of CDK4 positive ESC showed cyclin D1 negative. In contrast, 11 of cyclin D1 ESC positive showed CDK4 negative. Fourteen out of fifty ESC showed both cyclin D1 and CDK4 positive whereas 13/50 ESC showed no reactivity with cyclin D1 and CDK4. We also found cyclin D1 and CDK4 positive cells in tissues near to ESC. Conclusions： Overexpression of cyclin D1 and CDK4 may involve in the onco-pathogenesis of ESC. The increase expression of cyclin D1 and CDK4 possibly related to the differentiation of ESC. The deregulation of cyclin D1 may be one of the early events during the development of ESC. The close relationship between cyclin D1 overexpression and metastasis indicates that cyclin D1 might provide some cell subtype with activated inclination of metastasis. The fact that negative expresion of both cyclin D1 and CDK4 in the same ESC sample suggests that there might be other mechanism regulating ESC progression.
Key words： Esophageal squamous cell carcinoma;cyclin D1; CDK4; Immunohistochemistry ▲
细胞周期的基本任务是保证DNA在S期忠实地复制，在M期两个特征性染色体拷贝均等地分配至两个子代细胞中，DNA复制和染色体分离的机制由细胞外信号使干扰隔离，而且其必要的、自治的本质意味着关键成分的破坏将使细胞极度衰弱，因此，在癌症中控制这些过程的基因就不应频发突变、缺失或扩增。通过限制点进入S期的通道是由周期素依赖性激酶（依次由cyclin D1、E和A来调节）控制的，通常CDK的活性需要周期素的结合,依赖正调及负调的磷酸化，可由至少CDK抑制蛋白的两个家族限制。D型周期素以生长因子感受器来起作用，其表达较之细胞在周期中所处位置来说更多地依赖于细胞外线索，由于细胞是从G0期进入细胞周期，一种或多种D型周期素（ D1、D2和D3）作为对生长因子刺激延迟的早期反应的一部分而被诱导[1]。
食管癌在我国是一高发癌，粤东地区又是食管癌的高发区，为了解cyclin D1、CDK4在粤东地区食管癌中的表达情况，探讨其在食管癌形成中的作用，本文拟对50例来自粤东地区的食管鳞状上皮癌进行研究。
1材料与方法
1.1标本来源
50例食管鳞状上皮癌标本选自汕头大学医学院病理教研室1996至1997年存档活检蜡块，病例来源均为粤东沿海地区（食管癌高发区），其中I级16例，II级27例，III级7例，有淋巴结转移者30例，无转移者20例，取10例正常食管粘膜作为对照。
1.2试剂
鼠抗人单抗CDK4(Ab-1,克隆号DCS-35)、cyclin D1/bcl-1单抗（Ab-1,克隆号DCS-6）均购自美国NEOMARKERS公司，免疫组化试剂盒Ultravision Detection System Polyvalent（抗鼠和兔，HRP/DAB）购自美国LAB Vision Corporation。
1.3免疫组化染色
按试剂盒提供的方法进行。切片厚4μm，经脱蜡水化后，阻断剂封闭，一抗室温孵育60分钟，PBS洗，二抗室温孵育10分钟，PBS洗，再经三抗室温孵育10分钟，PBS洗后用DAB显色。阳性反应为棕褐色。阴性对照用PBS替代，阳性对照采用中山医科大学病理教研室已知为CDK4及cyclin D1阳性的骨肉瘤切片，阳性结果的判别采用双盲法，根据阳性细胞所占面积分为四个等级，“－”为无明显阳性反应细胞，“＋”阳性细胞的面积＜25％，“＋＋”阳性细胞的面积在25％～75％之间，“＋＋＋”阳性细胞的面积＞75％。一抗的效价分别为CDK4 1∶80、cyclin D1 1∶100。
2结果
2.1cyclin D1在正常食管及食管鳞状上皮癌中的表达情况
正常食管粘膜上皮的基底层及近基底层细胞呈现低水平的cyclin D1的表达，其阳性部位位于细胞核，未见胞浆阳性。在50例食管鳞状上皮癌中有27例表现为cyclin D1阳性（均为胞核阳性），其中12例为中等程度阳性，8例为强阳性（图3），另有7例为弱阳性表达（图2）。在相应的癌旁组织亦发现cyclin D1阳性反应（图4）。
图1食管鳞状上皮癌（Ⅱ级），CDK4阳性，
可见癌巢中癌细胞胞核着色，免疫组化染色，100×
图2食管鳞状上皮癌（Ⅱ级），cyclin D1阳性，
可见癌巢中癌细胞核弱阳性表达，免疫组化染色，100×
图3食管鳞状上皮癌（Ⅰ级），癌巢中核强阳性细胞清晰可见，
cyclin D1免疫组化染色，40×
图4食管鳞状上皮癌（Ⅱ级），癌旁组织可见食管上皮各层均有cyclin D1阳性细胞，
以基底层和棘细胞层反应较为突出，阳性部位位于核内，
免疫组化染色，100×（所有阳性反应均为棕褐色）
2.2CDK4在正常食管上皮及食管鳞状上皮癌中的表达情况
正常食管粘膜上皮细胞呈现低水平的CDK4的表达，主要分布在基底层细胞和棘层细胞。26/50例食管鳞状上皮癌表现为CDK4阳性（图1），其中中等程度阳性为10例，3例强阳性，13例为弱阳性，在26例CDK阳性中，有12例cyclin D1为阴性表达，另有14例cyclin D1为阳性，24例CDK阴性者有13例cyclin D1亦表达阴性，11例cyclin D1表达阳性。现将cyclin D1和CDK4在不同级别、不同转移状态食管癌中的表达情况总结于表1和表2。
表1 Cyclin D1、CDK4在不同级别食管鳞状上皮癌中的表达
| 分化程度 |
n |
阳性例数 |
| cyclin D1 |
CD4 |
| Ⅰ |
17 |
9 |
7 |
| Ⅱ |
28 |
13 |
16 |
| Ⅲ |
5 |
5 |
3 |
表2 Cyclin D1、CDK4的表达与食管鳞状上皮癌转移的关系
| 转移状况 |
n |
阳性例数 |
| cyclin D1 |
CD4 |
| 转移 |
30 |
16 |
15 |
| 未转移 |
20 |
11 |
11 |
3讨论 来自许多细胞周期研究及分子肿瘤学实验室的资料表明，在各种类型人类肿瘤中已发现，p16、cyclin D1、CDK4和Rb四种基因产物特征性的异常。这些基因的产物构成了调节通过G1期生化路径的进程，因之，在多种肿瘤类型中，人染色体9p21上的p16基因缺失突变或因启动子甲基化而静止[2,3]，在一些类型的肿瘤中人染色体11q13上的cyclin D1基因扩增、重排或过表达（如甲状旁腺癌、B细胞淋巴瘤等），而染色体12q13上的CDK4基因在胶质瘤和骨肉瘤中扩增[4,5];13q14上的Rb基因是最早的肿瘤抑制基因，可由突变、缺失或被DNA肿瘤病毒的癌蛋白分离而失活[6]，在生化水平上，cyclin D1与CDK4或CDK6的激酶复合体似乎在G1晚期通过磷酸化PRB而促进跨过关卡点的过程，该过程可被CDK4/CDK6抑制子负调[4,5]。与它们在细胞周期调控中正性对负性、在肿瘤形成中高能状态对失活状态相一致的是，cyclin D1和CDk4可作为原癌基因，而pRB和p16则作为抑癌基因，经证实cyclin D1/CDK4的G1加速功能和p16的生长抑制均严格要求有功能性pRB存在[3～6]，即所谓cyclin D1-CDK4-p16在Rb上游与之相互作用。四种细胞周期调节子在相同机制中的参与以及沿着该路径事件发生的顺序已获得有力证据的支持。所有这些资料形成了这样一种概念，即cyclin D1、CDK4、p16和Rb在肿瘤形成的共同路径中是可互相替代的：四者之一发生异常似可得到一样的结果，即因pRB生长抑制能力的功能性失活而促进细胞周期进程。
在细胞周期调控性原癌基因中最突出的是Cyclin D1,其异常与几种常见的肿瘤类型的分子病理形成过程有关[5，7]。cyclin D1通过与CDK4和CDK6结合并激活它们而发挥其在G1期中必要的和限速功能[8]。这些激酶又依次由几种抑制性多肽负调。D型周期素和它们配对的激酶似乎控制G1中/晚期的细胞周期的关卡点，通过与Rb蛋白的密切相互作用[9,10]。
染色体11q13的扩增在大范围普通成年肿瘤中频发，这包括头颈部鳞状细胞癌（平均为43％病例）、膀胱癌（15％）、原发乳腺癌（13％）、小细胞肺肿瘤及肝细胞癌（0～10％）[11]。在肝和头颈部癌中存在着 D1与cyclin D1蛋白过表达的相关性，而在乳腺癌中（ D1扩增频率仅为13％），超过5％者出现该蛋白的过表达。尽管 D1基因扩增频率很低，cyclin D1的异常过表达在骨肉瘤、结直肠肿瘤及黑色素瘤中亦可见到[11]。对转基因鼠的研究发现，D1在乳腺上皮中的靶向性过表达导致导管过度增生以致最终形成肿瘤，这提示cyclin D1对肿瘤形成有直接作用[12]。相反，无D1的小鼠在妊娠过程中表现出深度的乳腺小叶腺泡发育缺陷。这表明，cyclin D1在该组织成熟过程中起着关键的、不可替代的作用[13]。上述证据说明，正常发育控制和肿瘤过程之间存在密切的相关。
本文的结果表明，cyclin D1在超过50％的食管癌患者中出现过表达，而在正常食管上皮cyclin D1仅呈现低水平的表达，这在一定程度上反映了cyclin D1的过表达与食管癌形成间的关系，即cyclin D1的异常参与食管癌的发生。在相应的食管癌旁组织中，我们也发现cyclin D1的表达，提示cyclin D1不仅参与食管癌的发生，而且在食管癌的发生中是一较早期的分子事件。本文的结果与Zheng等[14]的报道一致。在27例cyclin D1阳性病例中，有16例伴有淋巴结的转移（表2），这可能提示cyclin D1不仅促进细胞的增殖，而且还可活化某些细胞亚群，使之出现转移的倾向。此外，cyclin D1的表达与食管癌的分化程度相关，cyclin D1的表达率逾高，食管癌的分化逾差（表1）。
G1期的CDK主要为CDK2、4、6，这三种CDK均可与D型蛋白形成复合体，而E型蛋白只与CDK2形成复合体。在细胞周期的G1期，CDK4/cyclin D1复合体磷酸化Rb产物并推动细胞周期的进程，因此，CDK4被认为是细胞周期的正性调节子。目前认为CDK4的过表达与肿瘤的发生关系密切，并把CDK4看作是一种癌基因。有人认为CDK4可能在一些细胞中是TGFβ介导的靶蛋白，用TGFβ处理人角化细胞时可抑制CDK4的mRNA表达;在MVILU用TGFβ处理时可引起CDK4蛋白的减少，但不影响mRNA的表达。CDK4的表达可使这些细胞抵抗TGFβ的生长抑制作用，提高CDK4水平能够中和p15的抑制效果。在人类一些肿瘤细胞中已发现CDK4和CDK6的高表达，但没有发现基因突变[15]。Shiozawa等[16]观察到CDK4在子宫内膜癌细胞的胞核及胞浆均表达，而以胞核的表达更典型，且在低分化的癌中表达更高，这说明在子宫内膜癌中核CDK4表达的增加的癌基因性质。同时他们还发现核p16的表达与CDK4的表达之间存在着反相关。我们发现，CDK4在食管癌病例中有较高的表达率（26/50），表明CDK4亦与食管癌的发生有关。从CDK4在不同级别的食管癌中的表达情况来看，CDK4似乎与食管癌的分化程度相关，即随着CDK4的表达增加，食管癌的分化越差（表1）。经与cyclin D1在食管癌中的表达相对照，结果显示，13例既不表达CDK4也不表达cyclin D1，这说明细胞周期调控路径中可能存在其他影响细胞周期进程的机制。对细胞周期其它调控因子的进一步研究(另文待发表)，将有助于阐述食管癌细胞周期调控的机制。
基金项目：本课题受广东省高教厅重点科研项目，广东省医学科学技术基金资助项目，李嘉诚汕头大学科研基金资助
通讯作者：Tel：86－754－8900433
Fax：86－754－8557562
Eminl：wsw99@163.net
参考文献：
［1］Sherr CJ. Cancer cell cycle [J]. Science, 1996,274： 1672～ 1677.
［2］Lukas J,Aagaard L, Strauss M, et al. Oncogenic aberrations of p16INK4/CDKN2 and cyclin D1 cooperate to deregulate G1 control [J]. Cancer Res, 1995,55： 4818～ 4823.
［3］Sherr CJ,Roberts JM. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases [J]. Genes Dev, 1995, 9： 1149～ 1163.
［4］Hunter T, Pines J. cyclins and cancerⅡ ： cyclin D and CDK inhibitors come of age [J]. Cell, 1994, 79： 573～ 582.
［5］Motokura T, Arnold A. cyclins and oncogenesis [J]. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1155： 63～ 78.
［6］Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control [J]. Cell, 1995, 81： 323～ 330.
［7］Bartkova J, Lukas J, Strauss M, et al. cyclin D1 oncoprotein aberrantly accumulates in malignancies of diverse histogenesis [J]. Oncogene, 1995, 10： 775～ 778.
［8］Bartkova J, Lukas J, Mü ller H, et al. cyclin D1 protein expression and function in human breast cancer [J]. Int J Cancer, 1994, 57： 353～ 361.
［9］Matsushime H, Quelle DE, Shurtleff SA, et al. D-type cyclin-dependent kinase activity in mammalian cells [J]. Mol Cell Biol, 1994, 14： 2066～ 2076.
［10］Meyerson M, Harlow E. Identification of G1 kinase for cdk6, a novel cyclin D1 partner [J]. Mol Cell Biol, 1994, 14： 2077～ 2086.
［11］Hall M,Peters G. Genetic alterations of cyclins, cyclin-dependent kinases, and CDK inhibitors in human cancer [J]. Adv Cancer Res, 1996, 68： 67～ 108.
［12］Wang TC, Cardiff RD, Zukerberg L, et al. Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice [J]. Nature, 1994, 369： 669～ 671.
［13］Sicinski P, Donaher JL, Parker SB, et al. cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast [J]. Cell, 1995,82： 621～ 630.
［14］Zheng J, Zhou C, Xiao F. The expression of Rb, p16 and cyclin D1 in 41 esophageal cancers [J]. Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih, 1996, 25(6)： 336～ 339.
［15］邱晓彦，杨贵贞.G1期细胞周期调节因子与细胞癌变[J].国外医学免疫学分册，1996，3：117～120.
［16］Shionzawa T, Nikaido T, Shimizu M, et al. Immuno-histochemical analysis of the expression of cdk4 and p16INK4 in human endometrioid-type endometrial carcinoma [J]. Cancer, 1997, 80(12)： 2250～ 2256.
收稿日期：1999－02－11
修回日期：1999－04－06
用户登录 
新用户注册