p16蛋白在食管癌中表达的回顾研究
中国肿瘤临床 2000年第1期第27卷 论著
作者:万文徽 王青 高学硕 李吉友 赵爱莲 何京生 鄂征 蔡红
单位:万文徽(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036);王青(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036);高学硕(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036);李吉友(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036);赵爱莲(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036);何京生(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036)鄂征(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036)
关键词:p16食管癌免疫组织化学
摘要目的:检测与分析p16蛋白在食管癌组织中的表达,从而探讨其与食管癌发生、发展 及预后的关系。方法:应用免疫组织化学检测p16蛋白在食管癌组织中的表达,应用χ2检验 、乘积限法、时序检验及COX模型等统计学方法进行统计学分析。结果:食管癌组织具有较 高的p16蛋白表达缺失率(49.5%);早期食管癌患者p16表达阳性率明显高于晚期(P=0.00 39);高分化鳞状细胞癌患者中p16表达阳性率明显高于中低分化患者(P=0.016);p16阳 性患者生存时间明显高于阴性患者(P=0.0007)。结论:p16蛋白可能成为辅助临床评价肿 瘤生物学行为、估计接受治疗的敏感性及判断预后的肿瘤标志。
Review Study of Expression of p16 Protein in Esophageal Carcinoma
Wan Wenhui Wang Qing Gao Xueshuo et al
(The School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing Cancer Hospital, Beijing)
Abstract Objective: To determine and analyse the expression of p16 protein in tissues of esophageal carcinoma and to probe its relation to the carcinogenesis, development and prognosis of esophageal cancer. Methods: The esophageal cancer tissue was examined immunohistochemically for expression of p16, and the data was analysed with Chi square test, product limited, Log Rank test and COX model. Results: The expression of p16 in esophageal cancer tissue had high a high deficient rate (49.5% ), and the positive rate in early stage was higher than that in late stage (P=0.003 9). The expression of p16 protein in highly differentiated squamous cell carcinoma was obviously higher than that of moderately and low differentiated ones (P=0.016). The patients with positive expression lived longer than the negative ones (P=0.000 7). Conclusion: p16 protein seems to be a useful tumor marker and it can be used to evaluate the tumor biological behavior, sensitivity to the treatment and prognosis of the disease.
Key Words p16 Esophageal carcinoma Immunohistochemistry
p16抑癌基因(MTS1,CDK4I)所编码的蛋白(p16INK4)是周期素依赖激酶抑制蛋白的一 种,在细胞周期进程中起负调控作用。p16蛋白缺失或异常可导致周期素依赖激酶4(CDK4) 活性上升,引起细胞增殖失控〖1〗。1994年以来,关于p16在多种肿瘤细胞株及人肿瘤组织 中表达的研究已为此提供了不少证据,表明p16与肿瘤发生、发展及预后有密切关系。
本研究应用本所制备的抗p16单克隆抗体(McAbs)对91例食管癌组织石蜡切片进行免疫 组织化学(IHC)检测,回顾性地分析了p16表达水平与食管癌临床分期、组织学分级及预后 的关系,从而,探讨p16的表达能否作为肿瘤临床估计对治疗敏感性及判断预后的标志。
1 材料与方法
1.1试剂
抗p16McAbs由本室制备[2]。具体是以p16蛋白末端17个氨基酸组成的多肽(美国QCB.I nc合成),为半抗原,以杂交瘤技术制备获得。经系统鉴定及免疫印迹实验证明,McAbs确 实针对细胞内p16蛋白,p16合成肽确实与细胞内存在的p16抗原组成成分相符。因此,此抗p 16McAbs具备在组织细胞内检测p16表达的应用价值。ABC试剂盒为美国Vector产品。
1.2病例与标本
食管癌91例,为1988年1月~1996年12月本院外科手术切除病例。其中,鳞状细胞癌84例 ,腺癌6例,基底细胞癌1例,均经本院病理科诊断证实并提供,标本经福尔马林固定、石蜡 包埋,切片厚度5μm。随访资料由本院统计室提供。
1.3IHC检测方法
以ABC试剂盒按常规方法操作。结果判断以细胞核及胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性,采用 双盲法,根据阳性细胞百分率分为四个等级:摚瓟无阳性反应细胞;摚珨阳性细胞<25 %;摚珨阳性细胞在25%~75%之间。“+++”阳性细胞>75%。
1.4统计学分析
以χ2检验分析p16表达水平与食管癌临床分期或与组织学分级的相关性。以乘积限法(P roductLimited)估计生存率曲线(Kaplan-Meier曲线),并以时序检验(LogRankTest) 进行曲线间的比较。为控制其它各因素对预后分析的影响,应用COX模型进行多因素预后分 析。以上所有分析在SPCC/PC统计软件包上完成。
2 结果
正常食管组织细胞胞核及胞浆内均存在p16表达。部分棘细胞层细胞低表达,基底层细胞 不表达。
2.1 食管癌组织中p16表达状况
91例食管癌组织中,45例(49.5%)表达阴性(图1)。其中,鳞状细胞癌p16缺失率为42/84(50%),腺癌为2/6(33.3%),基底细胞癌1例无p16表达;46例(50.5%)p16表达 阳性,其中,“+”10例(11.0%)、“++”16例(17.5%)、“+++”20例(22.0% )。
图1 食管腺癌IHC染色,可见正常腺体细胞呈阳性,肿瘤组织细胞呈阴性×200
2.2 p16表达与食管癌临床分期(TNM法)的关系(表1)
食管癌Ⅰ、Ⅱ期p16阳性表达率为66.7%,Ⅲ、Ⅳ期p16阳性表达率为41.4%,两者之间 存在显著性差异(P=0.0039),阳性分布情况与分期呈负相关。
2.3 p16表达水平与食管鳞状细胞癌组织学分级的关系(表2)
表1 p16在食管癌各临床分期中的表达
临床分期 |
p16表达水平 |
阳性率% |
- |
+ |
++ |
+++ |
Ⅰ(n=1) |
0 |
0 |
0 |
1 |
100.0 |
Ⅱ(n=32) |
11 |
7 |
9 |
11 |
65.5 |
Ⅲ(n=56) |
32 |
9 |
7 |
8 |
42.8 |
Ⅳ(n=2) |
2 |
0 |
0 |
0 |
|
表2 p16在食管鳞状细胞癌不同组织学分级中的表达
临床分期 |
p16表达水平 |
阳性率% |
- |
+ |
++ |
+++ |
高分化(n=41) |
15 |
5 |
8 |
13 |
63.4 |
中分化(n=26) |
16 |
3 |
3 |
4 |
38.5 |
低分化(n=17) |
11 |
2 |
3 |
1 |
35.3 |
高分化组与中、低分化组之间p16表达水平存在显著性差别(P=0.016)。中分化组与低 化组p16表达水平无显著性差别。2.4 p16表达水平与食管癌预后的关系
统计根治术后患者食管癌组织石蜡切片标本84例。
2.4.144例p16表达阳性者中,17例死亡,死亡率为38.6%,中位生存时间为123个月,平 均生存时间为91.3个月。40例p16表达阴性者中,26例死亡,死亡率为65%,中位生存时间 为16个月,平均生存时间为26.4个月。
2.4.2生存曲线(Kaplan-Meier)
见图2。
图2 生存曲线
以Log-Rank检验进行曲线比较,其P值为0.0007,表明p16表达阳性与阴性间生存率存在显著性差异,后者较前者明显降低。
2.4.3有关84例食管癌预后因素COX模型分析
见表3。
通过COX模型,控制其它因素如年龄、性别等,可见p16表达与预后有关,表达阳性者预 后好。
表3 84例食管癌预后因素COX模型分析
因素 |
回归系数 |
标准误 |
t值 |
P值 |
均数 |
性别 |
0.6920 |
0.5479 |
1.263 |
0.210 |
0.7926 |
年龄 |
-0.0222 |
0.2051 |
-0.108 |
0.914 |
1.9634 |
分期 |
0.4333 |
0.2004 |
2.162 |
0.034 |
2.2195 |
组织学分级 |
0.1122 |
0.2092 |
0.536 |
0.593 |
1.7848 |
p16表达水平 |
-0.8672 |
0.3737 |
-2.320 |
0.023 |
0.5243 |
3 讨论 p16蛋白是细胞周期重要的负调控因子,近几年的研究显示,人多种恶性肿瘤中普遍存在 p16基因及其表达产物的失活;将p16基因导入小鼠体内可使肿瘤生长受到抑制[3]。因此 ,检测p16在肿瘤组织中的表达水平,探讨其与肿瘤发生、发展及预后的关系,对于肿瘤临 床具有实际意义。
本研究以抗p16McAbs应用IHC法检测91例原发性食管癌p16的表达状况,并对于p16与临床 TNM分期、组织学分级与预后的关系进行回顾性分析。
1)食管癌组织中缺失率(49.5%)较高,提示食管癌的发生与p16的失活有关。2)早期( Ⅰ、Ⅱ)食管癌中,p16蛋白的表达明显高于晚期(Ⅲ、Ⅳ),表明p16缺失可能与食管癌的 进展有关。3)高分化鳞状细胞癌p16表达明显高于中、低分化者,二者之间存在显著性差别 ,表明p16表达与食管癌分化程度呈正相关。但中、低分化之间p16表达无明显差别,可能是 限于例数,不足以显示实际趋势,但亦不排除p16表达与分化程度之间无明确关系的可能。 本研究还发现,某些低分化肿瘤组织p16蛋白表达呈强阳性。许多研究已证明,p16、Rb蛋白 、周期素依赖激酶(CDK4)及周期素D(CyclinD)共同组成反馈调节通路,Rb与p16的表达 存在明显负相关[4]。因此推测,p16表达强阳性的肿瘤组织可能存在Rb蛋白的失活,致使 p16表达反馈性升高,可通过检测Rb的表达进一步证实。4)近来,关于p16表达水平与肿瘤预 后关系的报道日益增加,Bartch曾报道,术后接受化疗的患者中,p16表达阳性患者平均生 存时间明显比阴性患者延长〖5〗。Taga等检测非小细胞肺癌标本,发现鳞癌p16表达缺失率 为39%,明显高于腺癌(20.3%),并且,p16表达阴性患者预后较阳性患者差[6]。日本 Takamura[7]与我国田辉等〖8〗进行食管癌研究,认为p16表达与该肿瘤预后相关,高表 达者预后好。Dong等在卵巢癌的研究中有相同发现〖9〗。本研究结果亦显示p16表达阳性患 者预后明显较阴性患者好。因此,检测p16的表达水平可能为临床对于患者治疗措施的制定 及预后的判断提供参考。
总之,p16蛋白在食管癌组织表达检测结果提示,p16蛋白可能成为辅助临床评价肿瘤生 物学行为、估计接受治疗敏感性及判断预后的肿瘤标志。
本文课题受北京市科学技术委员会基金资助(编号952100900)
作者单位:蔡红(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院 北京市100036)
参考文献
1,Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in control causing specific inhibition cyclin D/CDK4. Nature,1993;366:704
2,万文徽,王青,李振甫, 等.抗 p16单克隆抗体的制备及鉴定,中国肿瘤 ,待发表
3,Jin XM, Nguyen D, Zhang AW, et al. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16INK4 gene mediated by an adenovirus vector. Cancer Res,1995;55:3250
4,Lukas J,Parry D,Aargaard L,et al. Ritinoblastoma protein- dependent cell- cycle inhibition by tumour suppressor p16. Nature,1995;375:503
5,Bartsch D,Shevlin DW,Callery MP,et al. Reduced survival in patients with ductal pancreatic adenocarcinoma associated with CDKN2 mutation. J Natl Cancer Inst,1996;88(10):679
6,Taga S, Osaki T. Prognostic value of the immunohistochemical detection of p16INK4 expression in non- small cell lung carcinoma. Cancer,1997;80:389
7,Takamura H, Fushida S, Hashimoto T,et al. Analysis of the p16INK4 p15INK4 genes abnormality and the amplification of cyclin D,gene in esophageal cancer. Nippon Rinsho,1996;54(4):1042
8,田辉,王善政, 陈明菊,等. 癌 p16基因表达及其临床意义.实用癌症杂志 ,1998;13(1):11
9,Dong Y, Walsh MD, McGuckin MA, et al. Increased expression of cyclin- dependent kinast inhibitor 2(CDKN2) gene product p16INK4a in ovarian cancer is associated with progression and unfavourable prognosis. Cancer,1997;74:57
收稿1999-03-09