人食管癌相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：苏涛　刘海玲　陆士新　赵新吉　周春晓　金顺钱

单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所［苏涛、刘海林、陆士新(责任作者)、周春晓、金顺钱］；河南林州肿瘤医院(赵新吉)

　　关键词： 食管肿瘤；基因表达；RNA，信使；聚合酶链反应；DNA，互补

　　【摘要】　目的　分离人原发性食管组织中新的相关基因，揭示食管癌的易感性与癌变原理。方法　用高效、灵敏的mRNA差异显示技术，以2例正常食管上皮、1例癌旁上皮、2例高癌家族的食管癌组织互为对照，通过对其基因表达的比较，找出差异条带，进行RT-PCR鉴定和DNA序列分析。结果　(1)在实验中，分离、鉴定了18个差异片段，其中包括正常组织表达而肿瘤不表达的正常食管基因(normal esophageal gene, NEG)13个，肿瘤表达而正常组织不表达的突变食管基因(mutated esophageal gene, MEG)5个。(2)4个NEG片段在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段，将其分别命名为食管癌相关基因1～4(esophageal cancer related gene, ECRG 1～4)。(3)其他14个cDNA片段分别与GenBank中的12个已知基因或片段同源，这些基因在食管癌中的作用还有待于进一步研究。(4)通过RT-PCR鉴定，已初步证明上述4个ECRG片段在正常食管上皮组织和食管癌中的表达有差异。(5)通过对7个人正常组织的cDNA文库检测表明，这4个ECRG片段在胎脑、成人脑、肝、肾、睾丸、骨髓及骨胳肌等组织中有表达。(6)20例肝、肺、乳腺、大肠和子宫内膜肿瘤及癌旁标本中，ECRG1和ECRG2片段均未见表达，ECRG3在各例标本中均有表达，ECRG4在个例癌旁标本中的表达均高于癌组织。结论　中国河南林县食管癌组织中ECRG1与ECRG2可能是新的食管癌相关的候选抑癌基因，它与食管癌的发生发展可能有关。

　　Cloning and identification of cDNA fragments related to human esophageal cancer　　Su Tao, Liu Hailing, Lu Shixin, et al. Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

　　【Abstract】　Objective　To search new genes related to human esophageal cancer(EC) for revealing carcinogenesis mechanism and genetic susceptibility of EC.Methods　Three normal esophageal epithelia(including 1 tumor-adjacent tissue) and two primary squamous cell carcinomas collected from high incidence family in Lin-xian county were studied using technique of mRNA differential display. The differential fragments were sequenced and identified by RT-PCR assay.Results　 (1)Eighteen differential fragments were isolated and identified, 13 of which were expressed in normal esophageal epithelia but not in EC(assigned as normal esophageal gene, NEG), while 5 were expressed in EC but not in normal esophageal epithelia(assigned as mutated esophageal gene, MEG). (2)Four NEG fragments were not homologous to the known sequences in the public database of GenBank (of NLM in USA). These 4 fragments were assigned as esophageal cancer related gene (ECRG) 1 to 4. (3)The remaining 14 fragments were homologues to 12 known genes or gene fragment. Their role in EC remains unclear. (4) Using RT-PCR technique, the expression of ECRG between normal epithelia and EC was significantly different. (5) All 4 ECRG genes were expressed in cDNA libraries derived from normal fetal brain, adult brain, liver, kidney, testis, bone marrow and skeletal muscle. (6) In the 20 cancerous and tumor-adjacent tissues obtained from the liver, lung, breast, colo-rectum and endometria, ECRG1 and ECRG2 was not detected by RT-PCR, while ECRG3 was highly expressed. For the ECRG4 the expression was much stronger in tumor-adjacent tissues than in cancerous tissues.Conclusion　ECRG 1 and ECRG2 may contribute to the causation and progression of the EC in Lin-xian, and may be candidates of tumor suppressor genes.

　　【Subject words】　Esophageal neoplasms　　Gene expression　　RNA, messenger　　DNA, complementary　　Polymerase chain reaction

　　肿瘤发生和发展的研究比单基因遗传病要复杂得多，它是诸多基因改变而共同作用的结果。我们在食管癌组织中发现有多种癌基因与抑癌基因的改变^［1～4］，但是未能找出与食管癌发生发展密切相关的新基因。因此，分离和鉴定与食管癌发生高度相关的新基因为食管癌癌变机理与易感性的研究以及临床诊断与治疗均有重要意义。我们报道以mRNA差异显示法从正常人食管上皮和中国河南省林县高癌家族的食管癌组织中分离与鉴定食管癌相关基因的初步结果。

材料与方法

　　1.组织标本：正常成人食管上皮取自意外死亡成人尸检标本，食管癌及癌旁组织取自河南林县肿瘤医院高癌家族手术标本，其他各脏器癌及癌旁组织取自本院和青岛医学院临床手术标本。所有标本离体后迅速放入液氮中冻存，后转入-80℃保存。

　　2.组织标本细胞总RNA的提取：按“分子克隆实验技术”提取。

　　3.引物：3’锚定引物(anchor primer): A 5’-CGG，GCG，TGG，TTT，TTT，TTT，TTT，TTA-3，G 5’-CGG，GCG，TGG，TTT，TTT，TTT，TTT，TTG-3’，C 5’-CGG，GCG，TGG，TTT，TTT，TTT，TTT，TTC-3’。5’随机引物(arbitrary primer)选用20～25碱基的长引物。

　　4.mRNA差异显示法，按Liang等^［5］法进行：(1)逆转录：分别将5例标本的Total RNA与3种3’锚定引物组合，逆转录出cDNA首链。(2)PCR扩增：取5支0.5 ml离心管，按顺序(正常A、正常B、癌旁、癌A、癌B)分别加入逆转录产物2 μl，以此为一组，可另设一组为平行对照。每管加入PCR反应液：Taq酶10×Buffer 2 μl，MgCl₂(25 mmol/L)1 μl, dNTP(250 μmol/L)1.6 μl,锚定引物(10 μmol/L)和随机引物(10 μmol/L)1 μl，Taq酶2U，［α-³²P］-dCTP(370 kBq/μl)185kBq,总计20 μl。94℃变性2分钟，42℃复性5分钟，72℃延伸5分钟，经1个循环。此反应目的在于合成cDNA的第2条链。然后94℃、56℃、72℃共40个循环。加入终止反应缓冲液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝)10 μl/管以终止反应。

　　5.回收及扩增差异片段：PCR产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、曝光后，回收其中的差异片段，放入0.5 ml离心管中，加入50 μl的PCR反应液：Taq酶10×buffer 5 μl, MgCl₂(25 mmol/L)3 μl,dNTP(250 μmol/L)4 μl,引物(10 μmol/L各1 μl, Taq酶2U，于94℃、56℃、72℃扩增30个循环。如有必要，可再做一轮PCR反应，即可获得足够量的差异片段用以克隆等进一步研究。

　　6.RT-PCR，按Pittman等^［6］方法进行。

结果

　　一、正常食管上皮与食管癌上皮的mRNA异显示分析

　　1.逆转录PCR：2例正常食管上皮与3例食管癌组织标本的Total RNA分别用3条锚定引物逆转录，然后再分别与46条随机引物相互配对进行PCR反应，共计690次。在PCR反应中掺入同位素［α-³⁵S］-dATP或［α-³²P］-dCTP均能显示出正常食管上皮与食管癌的差异条带(图1)。实验多次证明反应重复性较好。

图1　差异片段ECRG1，箭头所指为ECRG1差异片段

　　2.差异条带的回收：根据放射自显影结果，差异条带可分为两组：正常及癌旁组织有表达而癌组织不表达的，命名为正常食管基因(normal esophageal gene, NEG)；正常及癌旁组织不表达而癌组织有表达的，命名为突变食管基因(mutated esophageal gene, MEG)。共分离并回收48条差异条带，其中NEG 35条，MEG 13条。

　　3.差异条带的克隆与序列测定：经过筛选，将上述48条差异条带中的22条进行扩增、克隆并测序，共计测定序列47个。除去相同序列及空载体序列后，得到18条不同的DNA序列，其中NEG 13条，MEG 5条。测序结果输入计算机，通过Internet互联网络在美国国立医学图书馆的GenBank数据库进行同源性检索，结果发现其中4条NEG无明显同源的人类已知基因或片段，可作为新基因的候选基因进一步研究，分别将其命名为食管癌基因ECRG1(204bp),ECRG2(160bp), ECRG3(277bp)和ECRG4(146bp)。

　　对于上述4个cDNA克隆片段的序列，我们重复测定一次以确保其准确性，同时确定上述4个cDNA片段的锚定引物上游均测得mRNA 3’末端特有的Poly A加尾信号序列AAUAAA。

　　二、差异片段的鉴定

　　为了鉴定所获得的4个未知基因的cDNA片段确实为阳性差异片段，选用灵敏的RT-PCR作为检测手段。首先根据其序列测定结果分别设计合成一对特异引物，用冻存的5例组织Total RNA为模板进行逆转录PCR分析。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以β-actin扩增产物作为内对照(图2)，可以看出，在正常食管上皮和食管癌之间除ECRG3片段的差异稍弱外，其他3个片段均有较明显的差异。

A，B：正常成人食管上皮组织；C：癌旁上皮组织；D，E：食管癌上皮组织；1：ECRG1重组质粒对照；2：ECRG2重组质粒对照；3：ECRG3重组质粒对照；4：ECRG4重组质粒对照

　　图2　组织标本RT-PCR结果

　　三、ECRG1～4在人其他组织内的表达

　　为了解ECRG1～ECRG4在人体各组织器官中的表达情况，我们收集了7个人cDNA文库和20例肿瘤及癌旁组织标本，用PCR方法进行检测。

　　1.在7个cDNA文库中的表达：取成人肝、肾、睾丸、胎脑、成人脑、骨髓、骨骼肌cDNA文库原液为模板，分别用上述4个cDNA片段的特异引物进行PCR检测，结果发现这4个片段在上述7个cDNA文库中均有表达。

　　2.在人肿瘤及癌旁组织中的表达：20例肿瘤及癌旁标本分别为肝癌3例、癌旁5例；肺癌1例、癌旁3例；乳腺癌2例、癌旁1例；子宫内膜癌3例；大肠癌1例、癌旁1例。提取各例标本的Total RNA,紫外分光光度计定量后逆转录为cDNA首链，分别用上述4个ECRG片段的特异引物进行PCR扩增，以β-actin为内对照。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶

附表　ECRG1～ECRG4在肿瘤组织中的表达

　　注：+为阳性，-为阴性，±为可能阳性；括号内数字为例数电泳鉴定。20例标本检测结果见附表。

讨论

　　随着分子生物学的发展和人类基因组计划的深入研究，致病基因的克隆与鉴定受到广泛的重视与研究。我国是世界食管癌高发国家之一，寻找食管癌高相关性基因对食管癌的防治将具有重要的理论与实际意义。筛选新基因的方法有基因文库筛选法、微卫星法等，我们选用了Liang于1992年建立的mRNA差异显示法，该方法具有高效、灵敏等优点。差异显示法自建立至今，已经多次改进并成功地应用于多种肿瘤研究^［7～9］。本实验根据我们的设想，主要在两个方面对该方法进行了改进：(1)用5个标本互为对照，同时进行RT-PCR反应，可以有效地消除rRNA、残余DNA及PCR反应本身可能造成的假阳性的影响，增加可信度。此外，4个ECRG未知基因片段用各自的特异对引物在5个标本的RT-PCR反应中均重复出差异结果，因而可以排除残余DNA或PCR反应本身造成的假阳性的可能。(2)为降低PCR反应可能造成的假阳性，我们用20～25碱基的长引物替代了试剂盒使用的13碱基引物作为随机引物，同时在锚定引物的5’末端添加一些G、C碱基以使其Tm值与随机引物相匹配。长引物的使用有利于回收的差异片段特异性的再扩增。

　　在用PCR检测的7个正常组织的cDNA文库中，发现4个ECRG基因均有表达。在20例肿瘤及癌旁标本中，未检出ECRG1和ECRG2基因有表达；ECRG3基因均有表达，且在各组织间差异不明显；ECRG4在各癌旁组织标本中有表达，在癌组织中基本为阴性。癌旁组织以正常组织为主，故ECRG4多为阳性表达。因此，它们可能是与食管癌相关的基因。但因所检标本量较少，还需对其进一步实验鉴定。我们认为，除ECRG3基因外，其他3个ECRG基因均有较大的研究价值。目前我们正在进行的工作包括继续确定ECRG1、ECRG2及ECRG4基因的全长cDNA序列，同时继续收集食管癌和其他各种肿瘤及癌旁组织的标本，做进一步研究。

　　本课题受国家八五科技攻关基金和国家教委基金资助

参考文献

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(收稿：1997-12-19　　修回：1998-02-12)