食管癌Rb基因启动子甲基化状态和甲基苄基亚硝胺对其影响的研究

中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 基础研究

作者：李华川　陆士新　冯骆　梁苑苑

单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所

　　关键词： 食管肿瘤；Rb基因启动子；甲基化；基因，抑制，肿瘤；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　分析Rb基因表达异常原因，研究Rb基因启动子甲基化状态和甲基苄基亚硝胺(NMBzA)对Rb基因启动子的影响。方法　采用限制性核酸内切酶酶切和PCR扩增方法。结果33.3%的食管癌组织Rb基因启动子存在MspⅠ型高甲基化，40.0%的食管癌组织Rb基因启动子存在Hpa Ⅱ型高甲基化。1例标本存在MspⅠ和HpaⅡ两种类型的高甲基化。恒河猴1次灌喂30 mg/kg NMBzA后1，2，3天，其食管上皮Rb基因启动子HpaⅡ、MspⅠ类型甲基化逐渐增强；第5天其Rb基因启动子HpaⅡ、MspⅠ类型甲基化程度明显下降。结论　食管癌组织中Rb基因表达异常可能与启动子高甲基化有关，NMBzA通过启动子甲基化对Rb基因调控产生影响。

　　Study on the status of methylation of Rb gene promoter in human esophageal cancer and effect of NMBzA on Rb gene promoter in monkey esophageal epithelium　Li Huachuan, Lu Shixin, Fong Luo, et al. Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021

　　【Abstract 】　Objective　To elucidate the cause of abnormal Rb expression in esophageal cancer (EC).Methods Methylation of Rb gene promoter was examined with restriction endonuclease digestion and PCR amplification.Results Of the 30 specimens of EC, 10 (33.3%) had MspⅠ type hypermethylation of the Rb gene promoter while 12 (40.0%) had HpaⅡ type hypermethylation and one had both type of hypermethylation. In monkey fed with a single dose of NMBzA (30 mg/kg) on day 0, increasing hypermethylation of both types of the Rb gene promoter in esophageal epithelium was found on day 1,2 and 3 but reduced on day 5.Conclusion　These data suggest that abnoromal expression of Rb gene may be related to hypermethylation of its promoter and carcinogen NMBzA can induce such hypermethylation in monkey esophageal epithelium.

　　【Subject words 】　Esophageal neoplasms　　Rb promoter　　Methylation　　Gene, suppressor, tumor　Polymerase chain reaction

　　当前，人们对食管癌组织中的癌基因c-myc、EGFr和抑癌基因已有较多的研究^［1，2］，并对食管癌组织中的抑癌基因Rb也进行了突变、缺失和表达的研究^［3，4］。甲基化是基因表达调控的一种方式，为了探讨Rb基因表达失活的原因，我们研究了Rb基因启动子甲基化状态。

材料与方法

　　一、材料

　　1.标本的收集：取我国林县食管癌手术标本，放液氮保存，运回实验室备用。

　　2.猴食管上皮的收集：恒河猴购自中国医学科学院医学生物所，猴龄为7～8岁，体重15～20 kg。甲基苄基亚硝胺(NMBzA)由本实验室合成，纯度为99%以上。NMBzA的剂量为30 mg/kg体重，给猴一次性灌喂NMBzA 1，2，3，5天后，分别处死，取猴的食管上皮，液氮保存，送回实验室备用。以不喂NMBzA的猴作为对照。

　　3.DNA提取：方法按文献［2］。

　　4.试剂：MspⅠ、HpaⅡ为宝灵曼公司(西德)产品，Taq DNA polymerase (promega)。

　　5.引物：5′-CGGGTACCGTCTAACATTTTCTATCT- TC-3′　5′-CCAGATCTCTTTTTCGGGGGGTTTTGGG-3′中科院生物物理所合成。

　　二、方法

　　1.酶切：取2 μg DNA样品分别用HpaⅡ和MspⅠ以20 U/μg酶量37℃过夜酶切消化。酚-氯仿抽提1次，乙酸铵-异丙醇沉淀。70%乙醇洗沉淀2次。真空干燥，溶解沉淀于水中，取1 μg DNA进行PCR扩增。

　　2.PCR扩增：50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0和0.1%Triton×100,80 mmol/L dNTP，25 pmol引物，1.7 mmol/L MgCl₂，2 U Taq DNA polymerase总体积50 μl。94℃30秒、45℃30秒、72℃1分钟循环30次，最后72℃5分钟。

　　3.电泳：1.5%琼脂糖电泳。

结果

　　一、食管癌Rb基因启动子甲基化状态

　　30例食管鳞癌中，10例在Rb基因启动子存在MspⅠ型高甲基化，占33.3%(图1)；12例在Rb基因启动子存在HpaⅡ型高甲基化，占40.0%(图2)；1例标本在Rb基因启动子存在HpaⅡ和MspⅠ两种类型高甲基化。

M：marker为pBR322-HinfI；1：正常食管上皮PCR扩增产物；2：正常食管上皮MspI酶切扩增产物；3～8：人食管癌MspI酶切扩增产物

图1　PCR扩增电泳图谱

M：marker为PUC 19-MspI；1：正常食管上皮PCR扩增产物；2：正常食管上皮HpaII酶切扩增产物；3～8：人食管癌HpaII酶切扩增标本

图2　PCR扩增电泳图谱

　　二、NMBzA对猴食管上皮Rb基因启动子的影响

　　1.MspⅠ类型甲基化：恒河猴一次灌喂30 mg/kg NMBzA后，在1，2，3天其猴食管上皮Rb基因启动子MspⅠ类型甲基化逐渐增强，第5天Rb基因启动子MspⅠ类型甲基化程度明显下降(图3)。

　　2.HpaⅡ类型甲基化：恒河猴一次灌喂30 mg/kg NMBzA后，在1，2，3天其猴食管上皮Rb基因启动子HpaⅡ类型甲基化逐渐增强，第5天Rb基因启动子HpaⅡ类型甲基化程度明显下降(图4)。

1：NMBzA灌喂5天未酶切直接PCR扩增电泳图；2：正常猴MspI酶切扩增电泳图；3～6：灌喂1，2，3，5天MspI酶切扩增电泳图；7：正常人食管上皮酶切扩增电泳图；M：1kb ladder Marker

图3　PCR扩增电泳图谱

M：pUC19-HaeIII酶切Marker；1：正常猴食管上皮未酶切扩增电泳图；2：正常猴食管上皮HpaII酶切扩增电泳图；3～6：灌喂1，2，3，5天HpaII酶切PCR扩增电泳图

图4　PCR扩增电泳图谱

讨论

　　DNA甲基化作用可以引起染色质结构、DNA构型、DNA稳定性以及DNA与蛋白质因子相互作用方式的改变，从而控制基因表达^［5］。当DNA处于高水平甲基化状态时，基因表达受抑制；当DNA处于低甲基化状态时，基因得以表达。过去发现食管癌组织中存在Rb基因缺失、突变和表达失活^［3，4］，但表达失活的原因不明。国外报道Rb基因启动子高甲基化状态，启动活性降低，表达受抑制^［6］。我们分析Rb基因启动子甲基化状态，发现33.3%的食管癌组织处于MspⅠ高甲基化状态，40.0%的食管癌组织处于HpaⅡ高甲基化状态。表明食管癌组织中，Rb基因表达异常与Rb基因启动子高甲基化有关。

　　HpaⅡ核酸内切酶能够切割CCGG识别序列，不可切割CmCGG序列；MspⅠ能够切割CCGG和CmCGG序列，不能切割mCCGG序列。HpaⅡ和MspⅠ不能够酶切Rb基因启动子，说明Rb基因启动子处于高甲基化状态。启动子启动活性降低，Rb基因表达受抑制。是什么原因引起Rb基因启动子高甲基化，值得深入探讨。

　　大量的流行病学和分子流行病学研究表明，甲基苄基亚硝胺致癌物是食管癌病因之一^［7，8］。我们的实验研究发现，NMBzA能引起猴食管上皮Rb基因启动子高甲基化。NMBzA一次灌喂恒河猴1，2，3天，其猴食管上皮Rb基因启动子HpaⅡ和MspⅠ类型甲基化逐渐增强，呈高甲基化状态；灌喂第5天其猴食管上皮Rb基因启动子HpaⅡ和MspⅠ类型甲基化明显下降。猴食管上皮Rb基因启动子高甲基化降低了启动活性，影响了Rb基因表达，而Rb基因启动子甲基化的降低可能与猴食管机体修复机制有关。根据Ohtani-Fujita等^［6］报道，Rb基因启动子高甲基化失活启动活性影响Rb基因表达。本实验研究表明，NMBzA通过影响Rb基因启动子高甲基化调控Rb基因表达。

　　本课题受卫生部青年基金资助

参考文献

　　1　Lu SH, Hseih LL, Luo FC, et al. Amplification of the EGF receptor and c-myc genes in human esophageal cancer. Int Cancer, 1988,2:502-505.

　　2　李华川，陆士新.人原发性食管癌组织中多种抑癌基因的研究.中华肿瘤杂志，1994，74：489-491.

　　3　李华川，陆士新，姜伟，等.食管癌组织中抗癌基因Rb的研究.中华肿瘤杂志，1990，12：161-164.

　　4　李华川，陆士新.食管癌组织中Rb基因突变与表达的研究.中华肿瘤杂志，1993，12：412-414.

　　5　Zingg J M, Jones PA. Genetic and epigenetic aspects of DNA methylation on gene expression, evolution, mutation and carcinogenesis. Carcinogenesis, 1997, 18:869-882.

　　6　Ohtani-Fujita N, Fujita T, Aoike A, et al. CpG methylation inactivates the promoter activity of the human retinoblastoma tumor-suppressor gene. Oncogene, 1993, 8:1063-1067.

　　7　李华川，陆士新，崔晓邢，等.人食管癌与NMBzA引起的人和猴食管上皮细胞中多种抑癌基因变化的相关性研究.中华肿瘤杂志，1995，17：249-253.

　　8　Lu SH, Camus AM, Ji C, et al. Mutagenicity in Salmonella typhimurium of N-3-methyl-butyl-N-1-methyl-acetonyl-nitrosamine and N-methyl-N-benzylnitrosamine, N-nitrosation products isolated from cornbread contaminated with commonly occurring molds in Linxian county, high incidence area for esophageal cancer in north China. Carcinogenesis, 1980, 1:867-870.

(收稿：1997-12-03　　修回：1998-02-13)