MAL基因在人食管癌中表达显著下调
中华肿瘤杂志 1999年第4期第21卷 基础研究
作者：许智雄 王明荣 蔡岩 徐昕 韩亚玲 吴孔明 王秀琴 吴旻
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点试验室
关键词： 食管肿瘤；MAL基因；基因表达；聚合酶链反应
【摘要】 目的 研究MAL基因在人食管癌中的表达下调状况。方法 采用Northern杂交和RT-PCR方法检测了MAL基因在41对配对的食管癌组织和相应癌旁食管粘膜中的表达；应用PCR和RT-PCR方法分析了MAL基因在3个食管癌细胞系EC109、EC8712和EC9706中的存在及其表达。结果MAL基因的表达水平在92.7%(38/41)食管癌组织中明显低于同一患者的癌旁食管粘膜。同时，MAL基因在3个食管癌细胞系中未见表达。PCR分析显示，这3个食管癌细胞系中均存在被分析的MAL基因片段。结论 MAL基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。
MAL gene is down-regulated substantially in human esophageal cancer
XU Zhixiong, WANG Mingrong, CAI Yan, et al. National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021
【Abstract】 Objective To investigate the status of expression of MAL gene in human esophageal cancer.Methods Expression of MAL gene was analyzed by Northern blot and/or RT-PCR in 41 pairs of human esophageal cancer tissues and matched adjacent normal mucosa, and three human esophageal cancer cell lines EC109, EC8712 and EC9706. MAL gene was analyzed by PCR in the three esophageal cancer cell lines.Results MAL gene expression was down-regulated substantially or barely detectable in 93%(38/41) of human esophageal cancer tissues while expressed at high level in all matched adjacent normal esophageal mucosa. In all 3 human esophageal cancer cell lines, expression of MAL gene was not detectable. PCR analysis showed that the MAL gene fragment analyzed was intact in the three esophageal cancer cell lines.Conclusion Down-regulation of MAL gene expression is of frequent occurrence in human esophageal cancer.
【Subject words】 Esophageal neoplasms MAL gene Gene expression Polymerase chain reaction
肿瘤的发生、发展涉及到一系列基因的结构改变和(或)表达异常。当前的研究重点已逐渐转向表达研究，即从质（结构）的改变转向质和量（表达）的改变［1］。肿瘤中表达下调基因分离是当前筛选候选抑癌基因的一种重要途径。我们应用一种改进的mRNA差异显示技术，分离了30多个在3对配对食管癌组织中均表达下调的cDNA片段［2］。其中的一个cDNA片段是人MAL基因的3′末端。已有报道MAL基因与T细胞和尿路上皮分化相关［3，4］，但至今尚未发现MAL基因在肿瘤发生、发展中起作用。本研究显示，MAL基因在92.7%(38/41)的人食管癌组织中表达显著下调。
材料与方法
1.材料：13对和28对食管癌组织及相应配对癌旁食管粘膜分别取自河南省安阳市肿瘤医院和本院住院患者。EC109、EC8712和EC9706为我室建立的人食管鳞癌细胞系［5］，细胞常规培养［5］至70%～80%饱和密度用于总RNA和基因组DNA提取。总RNA应用Trizol试剂(Gibco公司)提取后用无RNase的DNase处理。基因组DNA采用常规蛋白酶K-酚法提取。
2.Northern杂交：20 μg总RNA经1.2%变性琼脂糖凝胶电泳分离后吸印至Zeta-Probe尼龙膜(Bio-Rad)。应用Prime-a-Gene系统(Promega公司)制备MAL（-28至+500核苷酸）探针。按照尼龙膜使用说明书进行预杂交、杂交和洗膜，-75℃放射自显影20～50小时。β-actin杂交带作为加样对照。
3.RT-PCR分析：3 μg总RNA用Superscript Ⅱ(Gibco公司)合成cDNA第一链。RT-PCR条件：30 μl反应体系含cDNA 1 μl，1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs, MAL和a-tubulin引物各0.5 μmol/L，Taq酶1.5U(Gibco公司)。94℃预变性3分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒，共30个循环后，72℃延伸5分钟。RT-PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶(含0.1 mg/ml溴化乙锭)电泳检测。MAL和a-tubulin的PCR产物大小分别为166 bp和410 bp。引物序列：MAL基因：上游：5′-AAGAT-CCTCTGCTGACCCCT-3′；下游：5′-ACCATGGACCTC-TGGAAAGA-3′。a-tubulin：上游：5′-CTCATCACAGG-CAAGGAAGGAT-3′；下游：5′-TTAAGGTTAGTGTAG-GTTGGGC-3′。
4.PCR分析3个人食管癌细胞系中的MAL基因：30 μl PCR反应体系含基因组DNA 200 ng，其余条件与RT-PCR相同。
结果
Northern杂交结果显示，MAL基因在14/15食管癌组织中表达显著下调(图1)。其中，在14例食管癌组织中未见其表达，而癌旁食管粘膜均高表达。1例的MAL基因表达下调不明显。
| T：食管癌组织；N：癌旁食管粘膜
图1 Northern杂交检测MAL基因在人配对
食管癌组织中的表达
RT-PCR结果表明，MAL基因在33/35食管癌组织中的表达明显低于相应的癌旁食管粘膜(图2)。未见表达和微弱表达的食管癌组织分别为21例和12例，而所有癌旁食管粘膜均高表达。同时，MAL基因在3个食管癌细胞系EC109、EC8712和EC9706中也未见表达，而PCR分析显示在这3个食管癌细胞系中都存在166 bp的MAL基因片段。 |
T：食管癌组织；N：癌旁食管粘膜；-：无模板DNA的阴性对照；M：X174/Hae Ⅲ分子量标志物
图2 RT-PCR检测MAL基因在人配对食管癌组织和细胞系中的表达
同时应用RT-PCR和Northern杂交检测了其中9对食管癌组织的MAL基因表达，Northern杂交与RT-PCR分析的结果相符。RT-PCR结果显示，MAL基因在5/9例食管癌组织中未见表达，在另外4/9例微弱表达；而Northern杂交则均未检测到其表达。上述结果可能是由于PCR扩增技术灵敏度较高的缘故。
讨论
MAL基因由Alonso［3］等于1987年分离得到，定位于2q13，含4个外显子，其cDNA全长为1 051 bp。MAL基因具有4种不同的剪接方式［6］。在人食管粘膜中，MAL基因主要以1.1 kb转录本存在（图1）。近来的研究表明，MAL、BENE、Plasmolipin和EST克隆H09290同属于一个大的基因家族。结构分析显示，它们均为四折跨膜蛋白质，是不溶于去垢剂的富含糖脂和胆固醇的膜微结构域成分［7-9］。MAL基因家族成员在多种组织如胃肠道、肺和肾等广泛表达，而且不同种属之间有同源蛋白质，提示它们在细胞中具有重要的功能，但MAL基因的生物学功能至今尚不清楚。最初Alonso等［3］发现MAL基因仅在T细胞分化的中、后期表达，推测它与T细胞分化相关。而Liebert等［4］观察到MAL基因在分化的尿路上皮细胞中表达上调，故认为其表达与尿路上皮分化相关。最近的研究表明，MAL基因可能是高尔基体和远端质膜之间囊泡转运和蛋白质分选的一个功能成分［8，9］。转染MAL基因后SF21昆虫细胞形成与哺乳动物细胞类似的囊泡结构［10］。我们应用Northern杂交和RT-PCR分析，发现MAL基因在92.7%（38/41）食管癌组织中表达显著下调，且在3个食管癌细胞系未见表达。这显示，MAL基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。另外，MAL基因家族成员BENE在食管癌组织中也表达下调；以MAL探针进行Northern杂交还发现3.1 kb和6.0 kb两个未知的转录本，他们在食管癌组织中也未见表达（结果未显示）。据此我们推测，MAL基因家族的其他成员也可能参与食管癌发生和(或)发展。由于MAL基因涉及到细胞分化、细胞内运输以及肿瘤发生发展等重要过程，有必要深入研究其生物学功能及其基因表达调节机制。PCR分析显示，在食管癌细胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。MAL基因表达下调的机制尚不明确，可能涉及到其启动子区甲基化、编码序列突变或其上游调控基因的功能异常。
本课题受863重大项目基金(编号Z19-02-01-03)、九五攻关项目基金(编号96-906-01-22)和攀登项目(编号 18)资助
参考文献
1 Sager R. Expression genetics in cancer: shifting the focus from DNA to RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 952-955.
2 许智雄，王明荣，蔡岩，等.人食管癌表达下调基因的分离和表达分析.见：孙方臻，主编.中国科协第三届青年学术年会论文集.北京：中国科学技术出版社，1998.226-228.
3 Alonso MA, Weissman SM. cDNA cloning and sequence of MAL, a hydrophobic protein associated with human T-cell differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 1997-2001.
4 Liebert M, Hubbel A, Chung M, et al. Expression of MAL is associated with urothelial differentiation in vitro: identification by differential display reverse-transcriptase polymerase chain reaction. Differentiation, 1997, 61: 177-185.
5 王秀琴，肖枫，王明荣，等.两个人食管癌细胞系的建立及染色体分析.中华肿瘤杂志，1998, 20: 5-8.
6 Rancano C, Rubio T, Alonso MA. Alternative splicing of human T-cell-specific MAL mRNA and its correlation with the exon/intron organization of the gene. Genomics, 1994, 21: 447-450.
7 Pérez P, Puertollano R, Alonso MA. Structural and biochemical similarities reveal a family of proteins related to the MAL proteolipid, a component of detergent-insoluble membrane microdomains. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 232: 618-621.
8 Magyar JP, Ebensperger C, Schaeren-Wiemers N, et al. Myelin and lymphocyte protein (mal/mvp17/vip17) and plasmolipin are members of an extended gene family. Gene, 1997, 189: 269-275.
9 Millán J, Puertollano R, Li Fan, et al. The MAL proteolipid is a component of the detergent-insoluble membrane subdomains of human T-lymphocytes. Biochem J, 1997, 321: 247-252.
10 Puertollano R, Li S, Lisanti MP, et al. Recombinant expression of the MAL proteolipid, a component of glycolipid-enriched membrane microdomains, induces the formation of vesicular structures in insect cells. J Biol Chem, 1997, 272: 18311-18315.
(收稿：1998-10-07 修回：1998-11-12)
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