食管癌中p16、Rb基因蛋白的表达及意义

肿瘤 1999年第5期第19卷 医疗研究

作者：蔡瑞君　王文亮　杨俊明　纪　娜　穆　峰

单位：蔡瑞君　杨俊明　纪　娜　穆　峰　第一军医大学南方医院胸外科(广州510515)；王文亮　第四军医大学病理教研室

关键词：食管肿瘤；基因表达；抑癌基因；免疫组织化学法

　　肿瘤抑制基因p16/MST1具有细胞周期的调节和抑制作用，并与许多肿瘤的形成、发展关系密切。研究结果表明体内可能存在一个包括p16、CDKs和pRb的细胞周期负反馈调节环路。文献报道在食管癌细胞系及原发食管癌中p16基因缺失和突变频率较高。为此作者进行了p16及Rb基因在食管鳞癌中的表达的研究，以期在蛋白水平探讨Rb和p16与食管鳞癌临床特征的关系，以及Rb与p16相互之间的关系，了解其在食管癌发生、发展中的作用及作用机制。

　　材料和方法

　　一、材料　收集我院胸外科1989～1993年中段食管癌手术切除蜡块84例，男49例，女35例，年龄35～73岁，平均年龄53岁。全部病例病理证实为食管鳞状上皮细胞癌，其中48例伴纵隔淋巴结转移，36例不伴淋巴结转移。对所有病例进行随访，回访44例，失访39例。随访时间由2～83个月不等，中位随访时间17个月。另取10例非肿瘤病死亡后食管等组织作为正常组织对照。

　　二、试剂及方法　兔抗人p16和鼠抗人Rb单克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公司，兔抗IgG及鼠抗IgG购自中山生物技术公司。采用免疫组织化学S-P方法，实验中同时设阳性阴性对照。

　　三、结果判定及统计处理　1、细胞阳性是指细胞核或/和细胞浆棕黄色显色；2、染色结果判定：阳性细胞数≥10%为阳性；3、统计方法：χ²检验、U检验、Kaplan-Mier生存曲线及Logrank检验。

　　结果

　　一、食管鳞癌p16、Rb基因表达结果

　　1.阳性率及阳性分布

　　p16蛋白表达在84例食管癌中阳性46例，阳性率为54.8%。p16蛋白主要位于细胞浆，部分位于细胞核，呈棕色、均匀的细胞颗粒着色(见插页第4页图2)，阳性细胞以局灶分布为主，部分呈散在分布，其它细胞和间质无阳性反应，正常食管粘膜部分阳性细胞位于粘膜上皮基层，散在分布。84例食管癌中37例Rb表达阳性，阳性率为44.0%；Rb蛋白定位于细胞核，呈棕黄色、细颗粒着色，阳性细胞分布在同一标本上表现为多样性。(见插页第4页图3)。正常粘膜未见阳性反应。

　　2.p16、Rb蛋白表达与病理分级、淋巴结转移、临床分期关系见表1。

图2　食管鳞癌组织　p16蛋白定位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状。S-P法×150

图3　食管鳞癌组组　Rb蛋白定位于细胞浆及细胞核中，呈颗粒状不均匀棕黄色。S-P法×150

表1　食管鳞癌临床特征与p16、Rb蛋白表达的关系

　　三、Rb表达与手术后生存期的关系

　　随访44例，死亡20例中Rb阳性11例p16阳性7例，生存24例中Rb阳性13例p16阳性17例。Rb表达与术后生存期无明显相关(P＞0.05)，p16表达阳性生存期长(P＜0.01)。

　　四、Rb与p16蛋白表达的相关性，见表2。

表2　Rb与p16基因在食管癌中的表达

　　(r=0.74，P＜0.01)

　　讨论

　　p16是1994年被分离和鉴定的一种新型抑癌基因，位于人染色体9p21区。Kamb等^［2］检测了290种不同肿瘤细胞系，发现75%细胞系p16基因缺失或突变；在食管癌等多种原发性肿瘤发现也存在p16缺失或突变^［3，4］。

　　本实验表明随着肿瘤细胞分化程度降低其p16蛋白表达阳性率下降，且缺失率与突变率的和肿瘤细胞恶性程度相关。提示p16基因在晚期食管癌可能缺失或突变频率增加：结果显示p16蛋白表达淋巴转移组明显低于未转移组，提示p16基因蛋白对食管癌的浸润和转移有抑制作用。在研究黑素瘤p16表达中也发现p16蛋白与淋巴结的转移及肿瘤侵袭性有关^［4］。同时随访结果表明，p16阳性病例组生存期与p16阴性组显著差异，表明p16阳性表达的食管癌患者比阴性患者预后好。

　　Rb基因是人类发现并克隆的第一个原癌抑制基因，定位于人染色体13q14区。Rb基因缺陷引起视网膜母细胞瘤的发生已基本明确，目前在小细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌及软组织肉瘤也检测到Rb基因的异常，在软组织肉瘤和白血病研究中发现Rb基因表达异常与预后有关^［5，6］。

　　本实验表明Rb蛋白的表达与肿瘤细胞组织分化相关，即肿瘤组织分化越差，其表达率越高。Rb蛋白表达与淋巴结转移、临床分期和预后无明显相关。但在临床分期中，晚期食管癌中Rb蛋白有逐渐增加趋势。

　　研究表明p16可直接结合及同cyclin D竞争结合CDK4或CDK6，阻断或抑制cyclin D-CDK4或CDK6复合物体对pRb蛋白的磷酸化作用，使细胞不能进入G₁/S期^［1］。Yan等^［8］提出了包括pRb、CDKs、p16和转录因子(TF)在内的反馈环模型，即pRb经过cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6作用发生磷酸化，导致pRb结合的TF的释放，TF或pRb分离后激活p16基因转录，p16增加使cyclin D-CDKs的激酶活性受到抑制，pRb磷酸化下降，保持活性状态，p16转录也随之降低。Shapiro等^［9］及Yeagor等^［10］发现pRb阳性细胞p16蛋白水平下降或检测不到，而Rb阴性的细胞p16阳性。许多研究也证实了体内存在上述细胞周期负反馈环路^［11］。

　　本实验结果与上述情况相符。pRb的失活可能刺激细胞在最终不需要抑制CDK4时增加p16表达，推测一些表达p16的标本可能由于调节性抑制。同时也不排除由于p16基因突变等造成表达无功能或功能下降的p16蛋白，使对CDK4的抑制作用降低，对p16转录的反馈作用消失从而使p16表达增加，此种情况下p16与Rb可共同表达。

　　以上结果说明p16基因在抑制食管癌的浸润和转移中起了重要作用，可做为食管癌患者预后及预测转移的指标，Rb基因蛋白可反映肿瘤的生长速度，p16基因可能通过Rb途径调节细胞生长。

　　作者简介：蔡瑞君，男，硕士，讲师，主治医师。

　　参考文献

　　［1］Marx JA.Challenge to p16 gene as tumor suppressor. Science,1994,264:1846

　　［2］Kamb A,Gruis N,Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially：involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264：436

　　［3］Zhou X,Tarmin L,Yin J, et al. The MTS1 gene is frequently mutated in primary human esophageal tumor.Oncogen,1994,9:373

　　［4］Liu L,Lassam NJ,Slingerlang JM, et al. Germlin p16INK4a mutation and protein dysfunction in a family with inherited melanoma.Oncogene,1995,11:405

　　［5］Bookstein R,Rio R,Mareperla SA, et al. Promoter deletion and loss of retinoblastoma gene expresion in human prostate carcinoma.Pro Natl Acad Sci USA,1990,87:776

　　［6］Yokote J,Akiyama T,Fung YK,et al.Altered expression of the retinoblastoma (RB) gene in small-cell carcinoma of the lung.Oncogene,1988,3:471

　　［7］Jian C,Martinez,Miguel A, et al. Retinoblastoma (Rb) gene product expression in lymphomas correlation with ki67 growth fraction.J Pathol,1993,169:403

　　［8］Li Yan,Nichols MA,Shay JW,et al. Transcriptional repression of the D-type cyclin-dependent Kinase inhibitor p16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRB.Cancer Res,1994,54(23):6078

　　［9］Shapiro GI,Edwards CD,Kobzik L, et al. Reciprocal RB inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res,1995,55:505

　　［10］Yeager T,Stadler W,Belair C,et al. Increased p16 levels correlate with pRB alterations in human urothelial cells.Cancer Res,1995,55:493

　　［11］Lukas J,Parry D,Aagaad L, et al. Retinoblastoma protein-dependent cell cycle inhibited by the tumour suppressor p16.Mol Cell Biol,1995,15:2600

(收稿日期：1998-03-13　修回日期：1998-07-09)