蛋白合成抑制剂促进TNFa 诱导大肠癌细胞凋亡

　　第一军医大学学报1999年第19卷第2期

梁卫江 黄卓垣 丁彦青 张万岱

　　摘　要：目的 探索放线菌酮和TNFα协同诱导人大肠癌LoVo细胞凋亡的发生规律。方法 用细胞体外培养方法，以放线菌酮和TNFα均小剂量作用于人大肠癌LoVo细胞，经Hoechst33258荧光染色，光镜观察形态改变，并用流式细胞术检测DNA断裂情况。结果 单用TNFα5 万U/L或放线菌酮4 mg/L，均未引起LoVo细胞凋亡效应。而两者协同，作用12 h至48 h，LoVo细胞逐渐出现明显的凋亡形态学改变和DNA断裂。结论 小剂量的放线菌酮和TNFα协同作用于人大肠癌LoVo细胞，出现明显的凋亡效应。

　　关键词：细胞凋亡　大肠肿瘤　肿瘤坏死因子α　放线菌酮

　　细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在基因调控，通过主动的生化过程而自杀死亡的现象。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一种细胞毒因子，通过与细胞膜表面TNF受体(TNFR)结合，激活细胞内信号传导系统，引起某些肿瘤细胞凋亡^[1]。是否引起细胞凋亡及其强弱，与TNFR的多少无关，而推测与是否产生保护性蛋白有关^[2]。本实验就保护性蛋白的存在与否，作进一步探索。

　　1材料与方法

　　1.1 细胞培养及处理 人大肠癌LoVo细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640(美国GIBCO BRL)培养液常规培养，5×10⁸/L传代至35 ml培养瓶中，对数生长期加处理因素。设两组。第1组又设4个小组各4瓶细胞，1小组为空白对照，2、3小组分别单加放线菌酮(Cycloheximide，CHX，Sigma)4 mg/L和TNFα(北京邦定公司基因工程合成)5 万U /L，第4小组加CHX 4 mg/L, 2 h后加TNFα5 万U/L，于48 h收集细胞。第2组设5瓶细胞，Ⅰ号瓶作为空白对照，Ⅱ-Ⅴ号瓶加CHX 4 mg/L， 2 h后加TNFα5 万U/L，分别于12、24、36和48 h收集细胞。

　　1.2 荧光染色显微镜观察 第1组细胞根据文献[3]进行Hoechst33258染色并观察形态改变。

　　1.3 流式细胞术检测 第2组细胞根据文献[3]进行碘化丙啶染色和检测。凋亡百分率用细胞仪计算，统计处理c ²检验。

　　2 结果

　　2.1 荧光显微镜观察 Hoechst33258只与双链DNA结合使核呈黄绿色，RNA和胞浆不着色。第一组每小组内各瓶细胞形态相似，1、2、3小组多为大小较一致、染色均匀的圆形核，偶见固缩浓染核。第4小组大多数为凋亡细胞核：固缩浓染，形态不规则，呈颗粒或小块状。

　　2.2 流式细胞术检测 I号DNA直方图显示LoVo细胞生活周期分布(图1a)，在G1峰前检出8.5%凋亡细胞。Ⅱ-Ⅴ号在G1峰前出现随作用时间延长而增高的亚G1峰（Ⅴ号见图1b）。细胞仪计算结果见表1。

图1 流式细胞仪对LoVo细胞内DNA的检测

　　Fig.1 Detection of DNA in LoVo cell by flow cytometry

　　a The DNA histogram of cultured normally LoVo cell

　　b The DNA histogram of LoVo cell after treatment for 48 h with CHX and TNFα

表1 CHX和TNFα协同作用不同时间的比较

Tab.1 Percentage of apoptotic LoVo cells treated by CHX and TNFαat different times

c ²=2407.2140 P ＜0.0001

　　apo=apoptosis cells

　　3 讨论

　　细胞发生凋亡时，形态学上出现特征性改变^[4]。流式细胞术检测可见亚G1峰^[5]。TNF通过与靶细胞膜上TNFR结合，引起细胞内一连串信号传导的变化，使Ca²⁺浓度增加，激活核酸内切酶，DNA在核小体连接处断裂，使多种肿瘤细胞发生凋亡^[4]。靶细胞的敏感性与TNFR多少无关，而可能与产生了保护性蛋白有关。加用代谢抑制剂，可能增强靶细胞对TNF的敏感性^[2]。CHX为蛋白合成抑制剂，对于不同的细胞株,可起抑制或诱导凋亡的不同作用^[6]。根据细胞种类不同，CHX或TNFα诱导凋亡剂量差别很大，但未见诱导大肠癌凋亡的报道。我们在试验中，用两者诱导LoVo细胞凋亡剂量分别为20 mg/L和250 万U/L以上。

　　本实验单用小剂量CHX 4 mg/L或TNFα 5 万U/L, 均未引起LoVo细胞凋亡的形态学改变；两者协同，则出现明显的凋亡形态学改变：Hoechst 33258染色后、在荧光显微镜下，大多数细胞核固缩浓染，呈颗粒或小块状。流式细胞术检测到，对照培养细胞在G1峰前就有8.5%的细胞凋亡，与国外文献报道相似^[5], 是在细胞培养及标本处理过程中发生的；两者协同，出现随作用时间延长而增高的亚G1峰和凋亡百分率。这可能是CHX抑制了LoVo细胞内阻止TNFα诱导凋亡的蛋白质的合成，使小剂量TNFα发挥凋亡效应。

　　临床已应用TNF治疗肿瘤, 但剂量大, 副作用大, 使用上受到限制。如果合用小剂量蛋白合成抑制剂，则可提高TNF的应用价值。本实验作为TNF诱导细胞凋亡机理的研究，为临床应用TNF治疗肿瘤提供了信息和理论依据。

　　作者单位：梁卫江 空军广州医院儿科，广州，510602；第一军医大学

　　黄卓垣 丁彦青病理学教研室，

　　张万岱南方医院全军消化内科研究所，广州，510515 )

　　参考文献

　　1曹 炜，牛建昭. 细胞凋亡的概念及其基因的研究进展. 日本医学介绍，1995,16(3):137

　　2 Kirstein M, Baglioni C. Tumor necrosis factor induces synthesis of two proteine in human fibroblasts. J Bio Chem, 1986,261:9565

　　3姜 泊，张亚历，周殿元. 分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社，1996,174～176

　　4 Fesus L, Peter JA, Piacentini M. Apoptosis; molecular mechanisms in programmed cell death. Eur J Cell Biol, 1991,56:170

　　5 Dolzhanskiy A, Basch RS. Flow cytometric determinaion of apoptosis in heterogeneous cell populations. J Immunol Methods, 1995,180:131

　　6 Van de Loosdrecht AA, Ossenkoppele GJ, Beelen RHJ et al. Apoptosis in tumor necrosis factor-α-dependent, monocyte-mediated leukemic cell death: a functional, morphologic, and flow-cytometric analysis. Exp Hematol, 1993,21:1628