大肠癌细胞端粒酶活性及端粒动力学研究

　　中华普通外科杂志2000年第15卷第7期

付强　朱理玮　王鹏志

　　 摘要 目的：探讨端粒动力学改变与端粒酶活化间的关系及其在大肠癌形成演化过程中的作用。方法：采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)-ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法检测58例大肠癌（tumor,T）及其中30例相应癌旁组织（paracarcinoma,P）、远癌切端肉眼正常粘膜组织（normal,N）和6例良性大肠疾患（benign,B）端粒酶活性（telomerase activity,TA）。应用Southern-blot-ECL（enhanced chemiluminescence）法对上述30例大肠癌患者T、P、N不同位点和6例良性大肠疾患的粘膜进行平均端粒长度（terminal restriction fragments,TRFs）测定。结果：T组TRFs值较P、N组明显缩短（T组与 p组Q值为3.70,P＜0.05；T组与N组Q值为4.24,P＜0.01），而端粒酶活性表达T组(91.4%)较P(23.3%)、N(6.7%)、B(16.7%)组明显增高(T组与P组比较H值为36.73，T组与N组比较H值为46.18，P＜0.01；T组与B组比较H值为14.24，P＜0.05)。T组TRFs值与其分化程度无明显相关（F值为1.95，P＞0.05），但相应P组TRFs随分化程度降低有缩短趋势（r=－0.3888,P＜0.05）。T组TRFs值随临床分期的进展而逐渐缩短（T组Dukes　D期与B期之间F值为4.85；D期与C期之间F值为5.45，P＜0.05）。结论：端粒的缩短与端粒酶的活化是大肠癌发生发展过程中的重要事件，可能成为早期检测大肠癌变的有效指标。对二者关系和临床特征的深入研究为大肠癌预后的判定与基因治疗提供实验依据。

　　 关键词：结肠肿瘤 端粒

　　大肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一。新近研究发现，染色体末端特异性结构-端粒（telomere）的不断缩短或丢失可以阻止细胞增殖，而端粒酶活化后可以自身RNA为模板，在细胞染色体末端不断合成添加端粒DNA序列，维持端粒长度的相对稳定，使细胞发展成为永生化细胞或具有无限增殖能力的癌细胞。为了探索端粒及端粒酶在大肠癌形成发展中的作用机制，我们对58例大肠癌和其中30例相应癌旁、远切端粘膜组织及6例良性病变进行端粒酶活性检测，并对上述病例中30例大肠癌、癌旁、远癌切端组织及良性病变中的3例进行端粒长度（terminal restriction fragments,TRFs）测定。

　　材料与方法

　　1.标本来源和处理：大肠癌58例，良性病变6例。标本均取材于肿瘤组织(tumor,T),癌旁5cm　(paracarcinoma,P)及远癌切端(normal,N)肉眼观察的正常粘膜。标本离体后经冷生理盐水冲洗去污，15～30min内取材，液氮速冻后转存至－80℃低温冰箱贮存备用。所有切除标本均经病理诊断证实。

　　2.主要试剂和设备：端粒酶（telomerase）聚和酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）-酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） 试剂盒(美国Boehringer Mannheim 公司产品);二辛可宁酸Protein assay Kit (美国Pierce Chemical Co. Rockford,IL); Telo Quant TM端粒长度（Telomere length ）Assay Kit(美国CAtalog#45228K PharMingen 公司）。

　　3．端粒酶活性TRAP (telomeric repeat amplication protocol,TRAP)检测：(1)全部操作均按kit提供的步骤在无污染条件下进行。(2)制备组织提取液：于-30℃低温切片机内制备冰冻切片，加入预冷的细胞裂解液，冰育。4℃，16000×g离心20min，上清液经液氮速冻后－80℃保存。预留10μl样品做蛋白定量。(3)取蛋白含量3μg细胞提取液建立TRAP反应体系(50μl)。反应参数如下：引物延伸25℃　30min;端粒酶灭活94℃　5min。扩增:变性94℃　30s, 退火50℃　30s,延伸72℃　90s,循环30次，后延伸72℃　10s, 4℃抑制。(4)将PCR产物与已包被链亲和素的微孔板进行杂交和ELISA反应，于酶标仪450nm处测量吸光值。

　　为便于对端粒酶活性进行半定量检测，本实验以试剂盒提供的293人胚肾细胞数目为10³，10²，10¹，10⁰的提取液做阳性对照，以RNase处理后细胞数为10³的293人胚肾细胞提取液做阴性对照，将端粒酶活性强度按+++（≥0.16），++（0.07～0.16），+（0.03～0.07），－（＜0.03）进行划分。

　　4.端粒末端限制性片段长度测定：经典法提取组织DNA，根据260nm处 的吸光值计算基因组DNA 浓度，取2.5μg DNA并建立限制性内切酶消化体系，HinfI/RsaI联合酶切，琼脂糖凝胶电泳，Southern blot印渍转膜。与生物素标记的端粒探针进行杂交，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）法显影，X-ray胶片曝光存档。底片上的杂交信号经光密度扫描仪（美国Bromma公司LKB2400 gelscan XL）检测2～23kb间吸光度A值及分布，依公式计算出样本DNA平均端粒长度。

　　5.统计学处理：端粒酶活性应用多个样本秩和检验，端粒长度应用方差分析和Spearman等级相关分析。

　　结果

　　1．大肠癌（T），癌旁组织（P），远切端组织（N）及良性病变（B）端粒酶活性比较：P、N组正常粘膜有微弱端粒酶活性，考虑与少量干细胞存在有关。为排除正常粘膜端粒酶活性的影响，将（+++）和（++）合并为阳性；（+）和（－）合并为阴性。

　　T组端粒酶活性阳性率显著高于其它三组，T组与P组比较H值为36.73，T组与N组比较H值为46.18，T组与B组比较H值为14.24，（P＜0.01）；P、N、B3组间差异无显著性 (表1)。

表1　T、P、N、B组端粒酶活性比较

　　2．30例大肠癌不同位点端粒长度：T组平均TRFs为(4.8±1.6)kb，较P组平均TRFs(9.9±2.6)kb和N组平均TRFs (10.7±2.5)kb明显缩短（方差分析显示T组与 p组Q值为3.70,P＜0.05；T组与N组Q值为4.24,P＜0.01）。Crohn's病1例TRFs4.1kb，管状腺瘤1例TRFs 6.4kb，较P、N组明显缩短，与T组接近。结肠憩室1例TRFs9.3kb，与P、N组相近。P、N组间差异无显著性（Q=0.53,P＞0.05）。

　　3．30例大肠癌不同分化程度与T、P、N组端粒长度（kb）的关系：方差分析显示：T组不同分化程度间TRFs差异无显著性（F=1.95，P＞0.05）；但等级相关显示：随分化程度的降低，相应P组TRFs呈缩短趋势（r=-0.3888,P＜0.05，表2)。

表2　30例大肠癌不同分化程度与

　　t、P、N组端粒长度的关系（X±s）

　　4．30例大肠癌不同临床分期与T、P、N组端粒长度的关系：方差分析显示，T组D期与B期之间F值为4.85，P＜0.05；D期与C期之间F值为5.45，P＜0.05。临床分期越晚，平均端粒长度越短(表3)。

表3　30例大肠癌不同临床分期与

　　t、P、N组端粒长度的关系（X±s）

　　5． 30例大肠癌T、P、N组端粒长度与端粒酶活性的关系：除6～8kb组与8～10kb组间端粒酶活性水平差异无显著性外，2～4kb、4～6kb、6～8kb三组的端粒酶活性水平均明显高于8～10kb组和大于10kb组（P＜0.05），但该三组间端粒酶活性水平差异无显著性（P＞0.05，表4)。

表4　30例大肠癌T、P、N组端粒长度与端粒酶活性的关系

　　注：应用成组设计多个样本比较秩和检验（H_c=52.80，P＜0.01）及多个样本两两比较秩和检验进行统计学分析讨论

　　由于“染色体末端复制难题”的存在^［1］，细胞在传代过程中染色体末端DNA结构-端粒将随细胞分裂而逐渐缩短，最终导致染色体不稳定，出现染色体断裂、融合、重排，进而衰老死亡。所以端粒长度被认为是细胞有丝分裂的时钟^［2］。由于端粒酶的活化，使端粒长度维持一种动态平衡，促成细胞的永生化最终获得无限增殖能力而转化为癌细胞。

　　我们发现端粒长度T组(4.8±1.6)kb，较P组(9.9±2.6)kb和N组(10.7±2.5)kb明显缩短，并随大肠癌临床分级的增高呈缩短趋势，大肠癌分化程度越差，恶性度越高，其相邻癌旁组织中端粒长度缩短越显著，表明端粒长度反映肿瘤的恶性度和侵袭性。在被检的3例大肠良性病变组织中除结肠憩室的端粒长度与癌旁及远切端差异无显著性外，管状腺瘤端粒长度（6.4kb）和Crohn's病端粒长度（4.1kb）均明显缩短，与大肠癌平均端粒长度相接近，提示腺瘤和Crohn's病作为大肠癌前病变已具备一定程度的恶性转化倾向。Hastie等^［3］在大肠癌及腺瘤的端粒动力学研究中也曾有相似报道。因此端粒长度的改变不仅反映了肿瘤恶性转化由量变到质变的动态发展过程，还为大肠癌预后评估及手术切除范围的制定提供依据。

　　近年来大量实验研究表明，多数恶性肿瘤端粒酶活性阳性^［4］，而正常体细胞中除少数生殖细胞、造血干细胞、生发层细胞具有端粒酶活性外，其余组织均检测不到端粒酶活性^［5］。Chadeneau等^［6］检测15例结肠癌，14例检测出端粒酶活性，而腺瘤性息肉和正常结肠粘膜均为阴性。Li等^［7］检测50例结肠癌，80%端粒酶阳性。本实验检测58例大肠癌及其中30例相应癌旁、远切端组织端粒酶活性阳性率分别为91.4%、23.3%和6.7%，6例良性病变中16.7%（1/6）端粒酶活性阳性，与文献报道一致。特别在1例病理诊断为直肠绒毛状腺瘤的组织中检测到TA的表达，提示在大肠癌癌前病变组织中已经存在端粒酶活化细胞群，端粒酶的活化可能是大肠癌变的前提并发生在癌变的早期阶段。因此，端粒酶活性的检测不仅对大肠良恶性病变具有良好的早期诊断、鉴别诊断价值，甚至可能成为常规方法不能明确诊断时的一项有效辅助手段。

　　我们通过对大肠癌端粒动力学改变与端粒酶活性水平进行比较，发现大肠癌96.7%端粒长度处于2～8kb间，而癌旁和远切端组织在此长度间仅占16.7%和10%，其中端粒长度在2～6kb者，94.1%TA阳性，6～8kb者69.2%TA阳性，而当端粒长度大于等于8kb时，仅有6.7%TA阳性，且其中仅有1例病理诊断为癌，端粒长度大于10kb时，未见癌诊断。然而与其对应的癌旁、远切端组织中端粒长度分别有83.3%和90%超过8kb。说明端粒的缩短与端粒酶活化之间存在某种内在联系，端粒酶的活化维持了端粒缩短和延伸的动态平衡，使细胞逃逸死亡而获得无限增殖能力达到永生。然而，在上述腺瘤和Crohn's病两例癌前病变组织中尽管出现了端粒长度的明显短缩，但均未检测到端粒酶活性，表明在端粒酶激活前该组织已较正常组织经历了更多的有丝分裂周期,端粒长度的缩短并非端粒酶激活的直接原因，端粒酶的活化还有赖于其它机制的调节。端粒酶的活化不是大肠癌变过程中的早期事件，而是在细胞发生转化基础上获得永生和无限增殖能力的晚期基因事件。

　　临床工作者一直在寻找一种只有恶性肿瘤中才存在的物质以指导临床诊断和治疗。端粒酶高度的敏感性和特异性超过以往任何肿瘤指标，提示端粒酶活化为恶性肿瘤所必须，从而给恶性肿瘤的诊断和治疗提供了广阔诱人的前景。特别是大肠癌端粒较正常组织端粒明显缩短这一事实，为端粒酶抑制剂的应用提供了机会。理想的端粒酶抑制剂可以使癌细胞端粒进行性缩短，在正常体细胞端粒遭受破坏之前衰亡，从而达到治愈的目的。因此，端粒酶抑制剂渴望成为大肠癌常规治疗后消灭体内残余肿瘤和微小转移灶的有效生物学手段。

　　作者单位：付强（300052天津医科大学总医院外科)

　　朱理玮（300052 天津医科大学总医院外科）

　　参考文献

　　1　 Harley CB. Telomerases. Pathol Biol,1994,42:342-345.

　　2　 Haber DA. Telomeres, Cancer, and Immortality. New Engl J Med，1995,332:955-956.

　　3　 Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, et al. Telomere reduction in human colorectal cancinoma and with ageing. Nature，1990,346:866-868.

　　4　 Kim NW. Clinical implications of telomerase in cancer. Eur　J cancer,1997,33:781-786.

　　5　 Dahse R, Fiedler W, Ernst G. Telomeres and telomerase: biological and clinical importance. Clin Chem，1997,43:708-714.

　　6　 Chadeneau C, Hay K, Hirte HW, et al. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer. Cancer Res，1995,55:2533-2536.

　　7　 Li ZH, Salovaara R, Aaltonen LA, et al. Telomerase activity is commonly detected in hereditary nonpolyposis colorectal cancers. Am J Pathol,1996,148:1075-1079．