端粒酶反义RNA对人髓性白血病细胞系HL-60的作用

　　第四军医大学学报2000年第21卷第4期

刘利　孙秉中　张传山　张惠中　阎严　张方信

　　摘　要：目的　探讨抗端粒酶在急性白血病治疗中的意义.方法 　用脂质体介导法将pBBS212-hT R(反义端粒酶RNA真核表达载体）导入人髓性白血病细胞系HL-60中，采用TRAP法测定端粒酶 活性，细胞生长动力学检测，电镜，DNA片段分析等方法观察其对HL-60细胞的端粒酶活性、 细胞增殖及细胞凋亡影响.结果　端粒酶反义RNA能显著抑制HL-60细胞的端粒酶活性，抑制H L-60细胞的增殖并促进其凋亡.结论　以端粒酶反义RNA抑制端粒酶活性是治疗白血病的潜在途径.

　　关键词:端粒酶；反义核酸；白血病；基因转染；细胞凋亡

　　0　引言

　　端粒是真核细胞染色体末端的一种保护性结构.对维持染色体的完整性及稳定性有重要作用 .端粒随细胞分裂而进行性缩短，最终导致细胞衰老或凋亡.端粒酶是一种特殊的由蛋白质 与R NA组成的核糖核蛋白聚合酶，它能以自身的RNA为模板合成端粒，以弥补复制造成的端粒缩短.端粒酶是恶性肿瘤细胞无限增殖的重要分子基础,其高表达（活化）与急性白血病等恶性肿瘤的发生密切相关.端粒酶已成为新的肿瘤标志物及肿瘤治疗的新靶点，端粒酶抑制剂亦成为治疗肿瘤的新策略.为探索抗端粒酶在急性白血病治疗中的意义，本研究采用脂质体介导的基因转染的方法将端粒酶反义RNA导入HL-60细胞，以探讨其对HL-60细胞端粒酶活性、生长、凋亡、及细胞周期等方面的影响.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　①细胞株: hL-60细胞,由本室保存培养. 人宫颈癌细胞系Hel a细胞,由唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室提供.人包皮成纤维细胞由本院烧伤科实验室提 供；②质粒与 菌种:大肠杆菌JM109由本校病理学教研室提供. pBBS212质粒及pBBS212-hTR(反义端粒酶RN A真核表达载体），由美国Geron corporation,Villeponteau博士惠赠. 该质粒由一个200 b p含端粒酶RNA模板序列TRC3的反义基因片段插入至pBBS212载体的EcoRI酶切位点而构建，在MPSV启动子控制下表达反义hTR^［1］；③主要试剂:核酸内切酶购自Promeaga公司. 端粒酶检测试剂盒(Telomerase PCR Elisa Kit)购自宝灵曼公司.脂质体转染试剂盒购自Gibco公司.

　　1.2　方法

　　1.2.1　端粒酶反义RNA表达载体转染HL-60细胞　质粒DNA的扩增提取按常规方 法进行. 把处 于对数生长期的HL-60细胞分为3组分别为：空白对照组；转染空载体pBBS212组(HL-60/pB bS 212)；实验组 ：转染pBBS212-hTR组(HL-60/pBBS212-hTR).转染方法按脂质体转染试剂 盒说 明书操作步骤进行.潮霉素（HyR）200 mg·L^-1筛选抗性细胞，7～10 d空白对照细胞全部死亡， 改用150 mg·L^-1维持培养2 wk后用于以下实验.

　　1.2.2　HL-60细胞的端粒酶活性检测　 ① 细胞端粒酶上清提取按文献［2，3］方 法进行. Hela细胞端粒酶上清为阳性对照,人包皮成纤维细胞及RNase处理Hela细胞上清为阴性对照. ②RT-PCR扩增：引物延伸：取上述提取液2 μL，加反应混合液， 置25℃，30 min,循环一次 ；端粒酶的灭活：94℃,5 min,循环1次；PCR扩增：50μL反应体系，包括dNTP,Taq 酶、生 物素标记的引物I和引物II，置94℃30 s,50℃ 30 s ,72℃ 90 s,循环30次；平衡：置 7 2℃ 10 min. ③扩增产物的检测：ELISA法：按试剂盒说明书操作步骤进行.测定450 nm和 655 nm的吸光度(A)值,根据A=A₄₅₀-A₆₅₅计算. pAGE电泳- 银染法: 配制125 g·L^-1的聚丙烯酰胺凝胶, 上样于凝胶孔内,20 V·cm^-1电压下电泳6 h.取出凝胶作银染色.

　　1.2.3　细胞生长动力学检测　采用台盼蓝拒染法.计算活细胞率,绘制细胞生长曲线 .

　　活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数＋死细胞数),

　　1.2.4　细胞凋亡的鉴定　① 形态学观察 倒置显微镜下观察;透射电镜观察:1×10⁶个细胞用PBS洗2次，用4 mL·L^-1戊二醛固定，锇酸后固定，脱水，包埋，超 薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜下观察并照相.②流式细胞仪检测. 收集不同处理的HL-60 细 胞，上机检测.测定细胞周期，观察G1期，S期，G2期细胞各占百分比.观察是否存在凋亡 细 胞及所占比例. ③ DNA片段分析:收集约1×10⁷个细胞，提取DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DNA电泳结果，设标准DNA分子量λDNA(EcoRI+HindⅢ)和未处理HL-60细胞及空载体pBBS212转染的HL-60细胞作对照.

　　1.2.5　统计学方法　采用t检验.

　　2　结果

　　纯化质粒DNA经紫外分光光度仪测A_260/280吸光度，其比值分别为1.82,1.90. 取少量DNA用EcoRI酶切及20 g·L^-1琼脂糖电泳，片段大小与pBBS212的背景资料图谱完全一 致. 表明该载体纯度好，反义hTR基因仍克隆在pBBS212载体中，可用于细胞的质粒DNA转染.

　　2.1　端粒酶反义RNA转染前后HL-60细胞的端粒酶活性改变　TRA p-ELISA法结果显示. 转染前HL-60细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度A值为3.016 ，而转染后HL-60细胞端粒酶活性，吸光度A值仅为0.315. tRAP-PAGE电泳 -银染法结果显示转染前HL-60细胞出现多条间隔6 bp的特征性阶梯性条带，而转染后HL-60细胞仅出现1～2条阶梯性条带，与ELISA方法检测的结果相符(Fig1).

图 1　TRAP-PAGE法检测端粒酶活性结果

　　fig 1　Detection of activity by TRAP-PAGE

　　1.Marker; 2.HL-60 cells; 3.HL-60/pBBS212-hTR cells; 4.HL-60/p BBS212 cells;5.Hela cells; 6.HL-60 cells treated by RNA enzyme; 7.Fibroblastic cells.

　　2.2　端粒酶反义RNA对HL-60细胞生长的影响　HL-60细胞的倍增时间为24～36 h，4 d以内呈对数生长，5 d以后死亡细胞逐渐增多，活细胞数下降.而HL-60/pBBS212-hTR细胞培养后48 h即可出现端粒酶反义RNA对其明显的持续的 抑制作用，与HL-60/pBBS212，HL-60细胞相比有显著差异（P＜0.05）.细胞倍增时 间延长至60～72 h(Fig 2).

　　2.3　端粒酶反义RNA对HL-60细胞的促凋亡作用　①形态学观察:光镜下观察HL-60/pBBS212-hTR细胞大部分形态正常与亲本HL-60细胞形态上无显著差别，但细胞生长缓慢，有一 些死细胞漂浮并可见有的细胞体积缩小，染色质浓缩，密度增高呈粗颗粒状浓集于核膜周围，胞质出现颗粒样物质，空载体pBBS212转染的HL-60 细胞（pBBS212/HL-60）与亲本HL-60细 胞形态上无显著差别. 电镜下观察HL-60/pBBS212-hTR细胞可见轮廓清楚，质地致密的染色质团块并边集，细胞骨架崩解，形成膜包裹的致密的凋亡小体.②流式细胞仪检测结果:检测 出 HL-60/ pBBS212-hTR细胞在G1期前有一亚二倍体的凋亡峰，凋亡细胞占全部检测细胞的15.8% ,G1 期细胞数明显高于对照组，且S期细胞数明显减少.而对照组未出现凋亡峰. ③DNA片段分析结果:紫外灯下观察，HL-60/pBBS212-hTR细胞DNA出现典型的梯状电泳条带.而对照组未出现典型的梯状电泳条带(Fig 3).

图 2　转染端粒酶反义RNA对HL-60细胞增殖的影响

　　fig 2　The effect of telomerase antisense RNA on HL-60 cells^aP＜0.05 vs HL-6o; ^aP＜0.05 vs HL-6o/pBBS212

图 3　DNA片段分析结果

　　fig 3　Agarose gel electrophorosis of DNA

　　1.Marker; 2.HL-60 cells; 3.HL-60/pBBS212 cells; 4.HL-60/pBBS212- hTR cells

　　3　讨论

　　大量的研究表明，绝大多数的肿瘤组织和肿瘤细胞表达端粒酶活性，而在绝大多数正常细胞中却检测不到端粒酶活性，端粒酶的活化与癌症的发生密切相关，通过抑制端粒酶活性来抑制肿瘤的生长是肿瘤治疗的新策略. 有研究报道，端粒酶RNA的反义核酸、肽核酸(PNA)及二脂类可以抑制端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖. greider等^［4］早就发现 ，将与四膜虫端粒酶RNA互补的寡核苷酸加入其提取液中，能使四膜虫的端粒酶失活. feng 等^［1］及Kan azwa等^［5］针对hTR(人端粒酶RNA)设计反义hTR及核酶(teloRZ),构建真核表达载体，分别转 染Hela细胞及HepG2/Huh-7肝癌细胞，均观察到它们对端粒酶活性的抑制作用.白血病细胞 株和白血病原代细胞中，端粒酶活性普遍高表达^［6，7］.为探索抗端粒酶对急性白 血病治疗 的意义，我们研究了反义RNA对端粒酶活性的影响.结果发现，转染前HL-60细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度A值为3.016 ，而转染后HL-60细胞端粒酶活性降低，吸光度A值 仅为0.315，表明端粒酶反义RNA能够有效地封闭或抑制端粒酶活性.细胞生长动力学显示端粒酶反 义RNA能够明显地抑制细胞增殖，延长细胞倍增时间；HL-60/pBBS212-hTR细胞FCM分析，发 现 G1期前有亚二倍体峰出现，占15.8%.而在未转染及转染空载体的对照组细胞中无此亚G1峰出现；电镜同步观察可见部分HL-60/pBBS212-hTR细胞出现染色质边集或形成凋亡小体；D NA片段分析可见典型的梯状电泳条带；而其他对照组细胞未见上述变化.表明应用反义hTR 封闭合成端粒的模板，除了抑制端粒酶活性外，还可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导白血病细胞的程序化死亡.抗端粒酶治疗可以避免对缺乏端粒酶活性的正常体细胞产生副作用.另外由于原始干细胞端粒酶活性低于其子代细胞，故对端粒酶的靶向治疗可能对干细胞的抑制作用较低.由此可见，抗端粒酶治疗在白血病的治疗中将具有潜在的应用前景.

　　作者简介：刘利(1966-)，男(汉族),吉林省集安市人. 博士 ，发表论文10篇. tel.(029)3577151(H);(029)3375579(O)

　　刘利（第四军医大学：西京医院血液科,陕西西安 710033,第四军医大学)

　　孙秉中（第四军医大学：西京医院血液科,陕西 西安 710033,第四军医大学)

　　张传山（第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安710033,第四军医大学)

　　张惠中（唐都医院全军骨肿瘤研究所)

　　阎严（唐都医院基础部微生物教研室)

　　张方信（兰州军区总医 院消化科）

　　参考文献：

　　［1］ Feng j,Funk WD,Wang SS et al. The RNA component o f human telomerase［J］. science,1995;269(5228):1236-1241.

　　［2］ Kim NW,Mieczyslaw A,Pialyszek MA et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］. science,1994;266(5193):2011-2015.

　　［3］ Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL et al. Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocal(TRAP)［J］. Method Cell Science,199 5;17(1):1-15.

　　［4］ Greider CW, Blacburn EH. A telomere sequence in the RNA of tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis［J］. nature,1989;337(6205):331-337.

　　［5］ Kanazwa Y, Ohkawak, Ueda K. Hammerhead ribozyme-mediated inhibition of telomerase activity in extracts of human hepatocellul ar carcinoma［J］. biochem Biophy Res Com,1996;225(2):570-576.

　　［6］ Seol JG, Kim ES, Park WH et al. Telomerase activity in acu te myelogenous leukemia : clinical and biological implications［J］. Br J hematol,1998;100(1):156-165.

　　［7］ Ohyashiki JH, Ohyashiki K, Iwama H et al. Clinical implica tions of telomerase activity levels in acute leukemia［J］. Clin Ca ncer res,1997;3(4):619-625.