慢性粒细胞白血病CD34+细胞的生物学改变与白血病的关系

　　国外医学输血及血液学分册2000年第23卷第3期

上海第二医科大学附属瑞金医院　上海血液学研究所　赖忠彬（综述）　孙关林（审校）

　　 摘　要　慢性粒细胞白血病（CML）是造血干细胞的克隆性疾患，CD34+细胞在CML中生物学行为的改变与CML的克隆性发病有直接联系。P210^bcr-abl蛋白酪氨酸激酶活性、信号蛋白磷酸化、造血微环境及细胞周期等因素的异常，导致了CD34+细胞生物学行为的改变。本文就近年CMLCD34+细胞与CML的关系及其生物学表现的研究作一综述。

　　 关键词 ：慢性粒细胞白血病　CD34+细胞　蛋白酪氨酸激酶　BCR-ABL蛋白

　　CD34抗原是表达于造血干/祖细胞表面的一种糖蛋白。慢性粒细胞白血病（CML）患者粒系、红系、巨核系和B淋巴细胞系，以及多能干细胞（CD34+Thy-1+）、B祖细胞（CD34+CD19+）、T/NK祖细胞（CD34+CD7+）、T祖细胞（CD34+CD7+CD5+）均有BCR-ABL融合基因^[1]，表明CML是造血干细胞的克隆性疾患。在CML中，86%±16%的CD34+细胞具有BCR-ABLmRNA^[2]。因而研究CMLCD34+细胞生物学行为的变化对于CML发病机制的阐明及其治疗具有重要意义。

　　1 CMLCD34+细胞的增殖分化

　　CMLCD34+细胞的增殖活性在体内外均增高，且体外不依赖于外源生长因子的刺激（胰岛素除外），而正常的祖细胞需要外源生长因子刺激才能保持其活力。Maguer-Satta等^[3]证实，高度纯化的CMLCD34+CD71-CD45RA-细胞（代表非常原始的细胞群）在不加任何生长因子时，可在体外存活、增殖并分化，时间长达几星期，而正常人的同样细胞在同样条件下很快死亡。这是因为P210^bcr-abl阻抑了由于细胞因子缺乏所致的凋亡。将CMLCD34+细胞和正常CD34+细胞共同培养，结果BCR-ABL（+）的CD34+细胞在体外不加任何外源生长因子时，可存活3～5天。而Albrecht等^[5]报告CMLCD34+细胞在撤除生长因子48小时后出现凋亡。

　　单一细胞因子在体外刺激CMLCD34+细胞增殖分化，正常细胞则需多种细胞因子协同作用。Moore等^[4]分离出单个CMLCD34+细胞，加入单一的干细胞因子（stem cell factor,SCF），6天后48%的细胞增殖到18（中位数）个细胞，正常CD34+细胞只有8%达到4（中位数）个细胞。SCF还可单独刺激BCR-ABL（+）的CFU-GM的生长，但SCF作用的同时，CD34+细胞的粘附功能却未恢复。

　　巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α）是一趋化因子，它对CD34+细胞的增殖分化起负性调控作用。正常情况下，骨髓中CD34+Thy-1-细胞（代表定向祖细胞）表面有MIP-1α受体。CML中，CD34+Thy-1-细胞表达MIP-1α受体水平较正常显著降低，导致CML祖细胞对MIP-1α的抑制作用反应丧失或重度低下^[6]。然而另有研究认为，CML祖细胞对MIP-1α的抵抗并非由于其受体下调，因为MIP-1α受体的亲合力和数量并无改变，而是由于ABL蛋白的蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性增高所致^[7]。单核细胞趋化物蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）是又一种内源性抑制因子，在LTC系统中抑制正常祖细胞活化，CML祖细胞则不受其控制^[8]。

　　总之，多数研究倾向于CMLCD34+细胞有比正常CD34+细胞更强的增殖力和对细胞因子更多的非依赖性。

　　2 CMLCD34+细胞周期动力学

　　CMLCD34+细胞中处于G₀期的细胞比正常的少。Traycoff等^[9]证实，在含有SCF、IL-3等细胞因子的培养基中，CMLCD34+细胞比正常CD34+细胞更早脱离G₀/G₁期。在外源性细胞因子缺乏时，30%的CMLCD34+细胞能进行周期更替，正常的则不能，但细胞凋亡程度却无差别。这些发现提示，CMLCD34+细胞较正常CD34+细胞周期活性有显著提高，这可能亦为CMLCD34+细胞恶性增殖的原因之一。

　　3 CMLCD34+细胞与凋亡

　　同正常的P145^c-abl相比，P210^bcr-abl抑制凋亡，其PTK活性增高5倍以上，且能使造血细胞发生恶性转化和NOD/SCID小鼠形成CML样的骨髓组织^[10]。BCR-ABL信号还激活造血祖细胞的细胞周期蛋白依赖激酶（CDK），诱导G₁期细胞转化至S期，促进DNA合成^[11]。

　　正常CD34+细胞中的干细胞群以不对称有丝分裂方式增殖，即一个干细胞分裂成的两个子细胞，其中一个分化为定向祖细胞，另一个保持原来干细胞的特性不变，以此来保持干细胞池的恒定。然而CMLCD34+细胞经凋亡诱导剂作用，一系列信号传导通路被激活，下游信号分子异常磷酸化，最终可发生凋亡^[12～14]。CMLCD34+细胞的凋亡与P210^bcr-abl有关，P210^bvr-abl阻抑凋亡，但亦有报告P210^bcr-abl可加速神经酰胺、TNF-a诱导的CMLCD34+CD71-CD45RA-细胞凋亡^[3]。

　　在CMLCD34+细胞，Fas信号传导通路是研究得最多的。Fas受体，亦称CD95或APO-1，是属于肿瘤坏死因子家庭的一种跨膜糖蛋白，表达在多种组织和细胞。CMLCD34+细胞亦表达Fas受体，表达水平显著高于正常的CD34+骨髓细胞^[12]。Fas受体将凋亡信号转导给正常细胞和CMLCD34+细胞，因此激动CD34+细胞的Fas受体可引发凋亡。Selleri等^[13]用Fas受体激动剂诱导CMLCD34+细胞凋亡，同时P210^bcr-abl水平下调。未凋亡的CMLCD34+细胞亦无P210^bcr-abl水平的下调。值得注意的是，CMLCD34+细胞凋亡的患者对α-IFN治疗敏感，无凋亡的患者对α-IFN无反应。表明Fas受体介导P210^bcr-abl下调，增加了CMLCD34+细胞对凋亡的敏感性。

　　抑制P210^bcr-abl的PTK活性，亦可增加CMLCD34+细胞对凋亡的敏感性。用Tyrphosin家族的选择性PTK抑制剂AG957单独作用于CMLCD34+细胞，其LTC-IC、CFU-Mix、BFU-E、CFU-GM的生长有显著抑制，并呈剂量依赖性。AG957同Fas受体的抗体CH11先后作用于CMLCD34+细胞，CFU-Mix、BFU-E、CFU-GM的生长抑制率分别增加1.6倍、3倍和4倍，而正常CD34+细胞经同样处理后抑制率无改变^[14]。显示CMLCD34+细胞的PTK活性被抑制后，细胞对Fas受体诱导的凋亡敏感性增加，祖细胞的增殖失控得到遏制。

　　实际上，在CMLCD34+细胞凋亡过程中，下列信号传导途径也被激活：RAS，STAT，PI-3K，NF-κB。另外，一些信号传导分子，包括P95^vav、CRKL、Shc、GRB-2和P120^abl等，亦在此过程中发挥作用。

　　同时，CMLCD34+细胞的凋亡亦伴随着下游信号分子磷酸化。已从CML造血祖细胞中分离出酪氨酸磷酸化的新蛋白P62^dok，它与120rasGTP酶激活蛋白（GAP）相关，继C-kit受体激活后被快速磷酸化，并与信号传导底物P21^ras、P120^gap协同参与BCR-ABL引发的CML致病^[15]。

　　神经酰胺诱导CMLCD34+CD71-CD45RA-细胞凋亡过程中，凋亡细胞的P210^bcr-abl磷酸化水平早期即开始增高，机制尚不清楚。P120^cbl和P46-56^shc是BCR-ABL编码的酪氨酸激酶的底物，继P210^bcr-abl之后二者的酪氨酸磷酸化水平亦很快升高。原因可能在于，P210^bcr-abl相关的两条凋亡途径——Ras途径通过P46-56^shc，PI-3激酶途径通过P210^cbl最终达到凋亡。 p210^bcr-abl磷酸化水平的升高，通过两条凋亡途径的级联反应使P120^cbl和P46-56^shc磷酸化水平进一步升高^[3]。

　　已经证实，CML的发病与凋亡受抑有关^[16]，神经酰胺、TNF-α、AG957、CH11等可诱导CMLCD34+细胞凋亡，尽管在CML的发病过程中，CMLCD34+细胞的凋亡是否受抑至今尚未肯定，然而诱导CMLCD34+细胞凋亡可能是CML的治疗策略中值得探索的一条途径。

　　4 CMLCD34+细胞（祖细胞）与造血微环境

　　有证据显示，CML祖细胞的异常聚集和循环部分是由于祖细胞同造血微环境异常的相互作用引起，主要表现为祖细胞对造血微环境的负性调节作用应答缺陷。

　　4.1 β₁整合素受体功能异常

　　在正常造血过程中，粘附受体的β₁系统，尤其是α₄β₁和α₅β₁整合素受体对骨髓微环境的粘附和归巢起重要作用。CD34+细胞的β₁整合素受体介导祖细胞粘附至基质上。此外，由β₁整合素受体转导的信号还调节造血祖细胞的正常增殖和分化；正常祖细胞表面β₁整合素受体的活化可抑制细胞增殖^[17]。虽然BCR-ABL+的CML祖细胞其整合素受体表达在正常水平，但其β₁整合素受体介导的CML祖细胞对基质的粘附以及纤维连接蛋白的α₄β₁和α₅β₁结合位点均有缺陷，表明其β₁整合素受体功能异常，导致CML祖细胞对β₁整合素介导的增殖抑制失去反应^[18]，祖细胞及其前体细胞以及分化的造血细胞大量扩增，祖细胞从骨髓中提前释出。

　　Bhatia等^[19]用断裂点特异的反义硫代寡核苷酸作用于CMLCD34+HLA-DR+细胞以封闭BCR-ABL，结果CML祖细胞对基质和纤维连续素的粘附作用显著提高，对整合素受体介导的增殖抑制的敏感性恢复。同时发现，CMLCD34+细胞的BCR/ABLmRNA和P210^bcr-abl水平显著降低，提示CD34+HLA-DR+细胞与基质的异常关系由P210^bcr-abl引起。

　　4.2 细胞骨架成份异常磷酸化

　　整合素信号的正常传导需要β₁整合素受体同细胞骨架成份的协调作用。CML祖细胞β₁整合素功能的异常与BCR-ABL融合基因有关。P210^bcr-abl通过磷酸化细胞骨架蛋白及一些对β₁整合素的正常功能起重要作用的信号蛋白改变β₁整合素的功能。细胞骨架成份，如α-actinin，talin，vinculin，tensin，paxillin，以及粘附斑（focal adhesion）多蛋白复合体中的FAK、PI-3K和PAFTK，均参与正常的整合素介导的信号传导，但在CML中被异常磷酸化^[20]。同时，CML祖细胞对层粘连蛋白（laminin）、胶原蛋白V的粘附增强^[21]。细胞骨架的改变干扰了P145^c-abl的正常功能，最终导致CML细胞的恶性增殖。

　　哈佛大学医学院一研究小组利用缩时视频显微术（time-lapse video microscopy）发现，bvr-abl mRNA（+）的CMLCD34+细胞，其细胞移动性、胞膜皱折程度、丝状伪足的形成能力以及在纤维连结蛋白结合的细胞表面伪足的伸出率和退缩率，同正常CD34+细胞相比均显著提高，上述表现均由bcr-abl蛋白PTK活性异常升高所致的细胞骨架改变引起^[21]。

　　4.3 细胞粘附成分缺陷

　　CMLCD34+细胞上某些粘附分子的缺陷是信号传导异常的成因之一。Kimura等^[22]发现L-选择蛋白（L-selectin）在CMLCD34+细胞上表达下降甚至缺失。L-选择蛋白是一细胞粘附分子，表达于白细胞上，在CD34+细胞与基质相互作用过程中，参与细胞间复杂的信号传导过程。L-选择蛋白的下降或者缺失从另一方面引发了CD34+细胞与基质相互作用的异常。

　　综上所述，CMLCD34+细胞在CML发病中的主要改变是细胞增殖力和周期活性提高，与凋亡有关的多条信号传导通路被活化，信号分子异常磷酸化，及其细胞粘附功能的缺陷。这些异常改变在CML的发病中起着极其重要的作用。但CMLCD34+细胞在CML中的改变是多重的、复杂的，上述研究可能仅仅反映了其作用的某些方面，确切机制有待进一步研究。

　　5 展望

　　近年来，大量研究发现了很多新的与bcr-abl结合的蛋白质，如PG2、dox、cbi、shc、Rin-1等，以及许多被其磷酸化的蛋白质，而这些蛋白质往往是信号传导通路的重要成份。通过这些蛋白质，bcr-abl激活多条信号途径，如Ras,P13/AKt,JAK/STAT,粘附途径等等。bcr-abl通过这些通路干扰细胞凋亡、生长、分化等。CMLCD34+细胞的异常生物学表现亦主要由bcl-abl引起。虽然越来越多的CD34细胞生物学特性被发现，但仍存在很多问题，如：①普遍认为CML是干细胞疾患，但干细胞（通常以CD34+细胞表示）准确的同一性及特性仍不清楚；②在CD34+细胞水平诱导细胞凋亡和杀伤细胞，无疑对CML的治疗具有重要意义，但在目前基础上还能走多远；③CD34+细胞的bcr-abl相关蛋白质及信号传导途径是如何导致CML发病的；④CML发病过程中，CD34+细胞的分化及各细胞系的选择性扩增如何控制，以及体内微环境及细胞因子同CD34+细胞的相互关系对CML发病所起的作用，等等。

　　所有CML的发病基础涉及t（9，22）的异常，这种遗传学上的同质性使研究容易获得突破。相信随着研究的深入，有关CML的所有问题终将得到正确答案。

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