大肠癌人巨细胞病毒感染与p53基因突变的相关性
中国肿瘤临床1999年第26卷第6期
侯治富 王维忠 杨绍娟 张文岚 吴晓冬 徐殿文
关键词:大肠癌巨细胞感染 p53基因突变
尽管人巨细胞病毒(HCMV)感染与人类肿瘤的关系还不十分清楚,但HCMV感染可导致原癌基因(如myc基因)的表达、生长因子转录、白细胞介素合成增加,酪氨酸羟化酶、多巴胺-β-羟化酶表达减少等。还有实验证实,神经胚细胞瘤体外培养中感染HCMV后,增加了瘤细胞的动能性(motility)和转移性。近年的临床研究中,报道了HCMV与宫颈癌关系十分密切,但有关大肠癌的报道较少。本文就大肠癌HCMV感染与p53基因突变关系进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集1994~1996年白求恩医科大学中日联谊医院外科切除大肠癌组织共60例,均经病理证实,并进行了Dukes′分期和组织分化程度分型。患者年龄38~72岁;男42例,女18例。
1.2 DNA模板制备
取-80℃冻存组织约1g,经组织研磨器研磨,加入1mlDNA裂解缓冲液,置55℃1小时,95℃15分钟,经13000rpm离心10分钟,上清即为DNA模板。再0.8%~1%低电渗琼脂糖凝胶电泳,以排除降解的模板。
1.3 PCR-SSCP检测p53突变
取上述DNA模板液10μl(约1μg),加入50μlPCR反应体系内 (dNTP250μmol/L,MgCl23.0mmol/L;KCl25mmol/L:TagDNA聚合酶2U;引物浓度为0.25pmol/L)。p53基因第2,3外显子引物P1:5′-CCCACTTTTCCTCTTGCAGC;P2:3′-AGCCCAACCCTTGTCCTTAC,PCR产物长度为278bp;第4外显子引物P1:5′-CCCTGTCATCTTCTGTCCCT;P2:3′-AGCCCCAGTGGGCAACTGA,产物长度为121bp;第5外显子引物P1:5′-TCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTC;P2:3′-ACCCTGGGCAACCAGCCCTGTCGTC,产物长度为282bp。PCR循环参数为:95℃充分变性5分钟,再行95℃60秒,55℃50秒,72℃120秒,共35个循环,最后72℃充分延伸5分钟。取PCR产物8μl,与6倍加样缓冲液混匀,加于2%低电渗琼脂糖凝胶电泳,5v/cm,30分钟后经EB染色,在紫外反射透射仪上观察扩增效果。阳性者,取PCR产物7μl,与36%甲酰胺、0.05%溴酚蓝混合,95℃加热变性5分钟,置冰水冷却,取7μl加入含10%甘油、12%非变性聚丙烯酰胺凝胶,室温下以5v/cm电泳4~6小时。同时做阳性、阴性DNA和空白对照,EB染色20分钟后用紫外反射透射仪观察结果。
1.4 HCMVPCR检测
DNA模板制备同上。HCMVPCR引物序列P1:5′-CCACCCGTGGTGCCAGCTCC-3′;P2.5′-CCC,GCTCCTCCTGAGCACCC-3′,产物长度159bp。PCR循环参数为94℃60秒,52℃120秒,72℃120秒,总共35个循环。产物鉴定经2%琼脂糖凝胶电泳,5v/cm,1小时,用EB染色20分钟,紫外反射透射仪上观察结果。
1.5 统计学方法
实验所得计数数据采用Kendall等级相关分析和χ2检验。显著性差异标准定于P≤0.05。
2 结果
2.1 大肠癌HCMV感染与大肠癌组织分化、临床Dukes′分期的关系
在60例大肠癌中,HCMVPCR阳性检出率为31/60(51.67%);不同组织分化的HCMV感染率分别为:高分化型43.75%,中分化型50.00%,低分化型55.55%,未分化型62.50%。Dukes′分期中,B1期为50.00%,B2期为50.00%,C1期为45.83%,D期为62.50%。经χ2检验和Kendall等级相关分析显示各组间HCMV感染率无显著差异(χ12=0.85,χ12=0.002,P>0.05,τ1=0.07,τ2=0.003)。
2.2 大肠癌HCMV感染与p53基因突变的关系
在31例HCMV感染的大肠癌中,p53基因突变率为29.03%(9/31),与非HCMV感染组比较,p53基因突变率显著增高(χ2=4.80,P<0.05,τ=0.11)。
2.3 大肠癌HCMV感染与大肠癌不同分化程度、临床分期中抑癌基因p53突变的关系(表1,2)。
表1,2可见,HCMV感染与大肠癌的组织分化程度、p53基因突变无显著差异(χ2=0.63和1.59,P>0.05);HCMV感染的病例,Duhes′分期越晚p53基因突变率越高,各组间差异显著(χ2=4.10,P<0.05)。
表1 大肠癌HCMV感染与大肠癌组织分化程度、p53基因突变的关系
大肠癌组织分化程度 |
HCMV(+) |
HCMV(-) |
例数 |
突变例数 |
突变率(%) |
例数 |
突变例数 |
突变率(%) |
高分化 |
7 |
2 |
28.57 |
9 |
0 |
0 |
中分化 |
8 |
1 |
12.50 |
8 |
0 |
0 |
低分化 |
11 |
4 |
36.36 |
9 |
2 |
22.22 |
未分化 |
5 |
2 |
40.00 |
3 |
0 |
0 |
HCMV(+)组χ2=0.63 P>0.05 Kendall τ=0.08 HCMV(-)组 χ2=1.59 P>0.05 Kendall τ=0.07
表2 大肠癌HCMV感染与Dukes′分期、p53基因突变的关系
Dukes′分期 |
HCMV(+) |
HCMV(-) |
例数 |
突变例数 |
突变率(%) |
例数 |
突变例数 |
突变率(%) |
A |
- |
- |
- |
-- |
-- |
- |
B1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
B2 |
5 |
1 |
20.00 |
5 |
0 |
0 |
C1 |
11 |
3 |
27.27 |
13 |
1 |
7.69 |
C2 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
D |
10 |
5 |
50.00 |
6 |
1 |
16.67 |
HCMV(+)组χ2=4.10 P<0.05 Kendall τ=0.07 HCMV(-)组 χ2=1.53 P>0.05 Kendall τ=0.07
3 小结
大肠癌的病因尚未明确,多数认为是一种多基因参与、多阶段演变的疾病。Kovacs等研究了HCMV感染的脐静脉内皮细胞p53基因呈现过度表达,而且主要集中在细胞核内,呈与细胞浆分离的状态。Cinatl等发现,HCMV感染使Bcl-2基因过度表达。本组资料中的60例大肠癌HCMVPCR阳性率为51.67%,明显高于本地区献血员。经Kendall等级相关分析发现,HCMV感染与大肠癌的Dukes′分期、组织分化的程度无关,但HCMV感染与p53突变有关;p53基因突变率随病情进展而增加,这一改变与组织分化程度无关。证实了大肠癌中p53基因突变与HCMV感染密切相关,其确切机理尚需进一步研究。
基金项目:本文课题受吉林省卫生厅科研基金资助作者单位:侯治富 王维忠 杨绍娟 张文岚 吴晓冬 白求恩医科大学第三临床学院中心实验室(长春市130031)
徐殿文 吉林省四平市妇婴医院