结直肠癌缺陷基因201密码子点突变与大肠癌生物学特性研究

　　中华普通外科杂志2000年第15卷第3期

　　吴文溪　马利民

　　 摘要　目的：探讨结直肠癌缺陷(deleted in colorectal carcinoma, DCC)基因201密码子（codon 201）点突变与大肠癌生物学特性的关系。方法：采用等位基因特异性（allele-specific）PCR扩增技术结合限制性片段长度多态性(restricted fragment length polymorphism, RFLP)检测40例正常人大肠粘膜、35例大肠癌组织及相应癌旁正常粘膜的201密码子突变情况。结果： 大肠癌组织及癌旁正常粘膜201密码子突变率分别为71%(25／35)和60%(21／35)，两者差异无显著意义。但与正常对照组33%(13／40)相比，显著增高（χ²=5.6963，P＜0.025）。伴淋巴结转移组和Ducks C、D群明显高于无淋巴结转移组和Dukes A、B期，而与患者性别、年龄、癌的分级、分型等因素无关。结论： DCC基因201密码子突变是大肠癌发生中的早期基因事件，且与其转移能力的加强密切相关。

　　 关键词：结肠肿瘤　基因　突变　聚合酶链反应

　　 结直肠癌缺陷（deleted in colorectal carcinoma，DCC)基因为1990年发现的一个抑癌基因，位于染色体18q^21.3，该基因编码的蛋白与神经细胞粘附分子高度同源，属于免疫球蛋白超家族，与机体许多正常生理功能有关^［1］。在众多肿瘤中DCC基因有不同程度的失活，大肠癌的失活频率很高^［2］，201号密码子是其热点突变部位，201密码子突变是DCC基因失活的重要机制之一。虽然DCC基因201密码子在大肠癌中的突变率很高^［3］，但与肿瘤临床病理的相关性研究国内未见报道。我们采用等位基因特异性(allele-specific, AS)PCR结合限制性片段长度多态性 (restricted fragment length polymorphism, RFLP)，分析正常大肠粘膜、大肠癌及相应癌旁正常组织DCC基因201密码子突变情况，以了解DCC基因201密码子在国人大肠癌中的突变情况以及与大肠癌临床病理学特征的关系。

　　资料与方法

　　一、标本采集

　　40例正常对照的大肠粘膜取自经纤维结肠镜活体组织学检查并经病理学诊断证实为非大肠肿瘤，且无大肠癌家族史的就诊患者。35例大肠癌组织及癌旁5　cm以外大肠粘膜取自我院1998～1999年外科手术切除标本，均经病理学检查证实为大肠癌。收集的新鲜标本用生理盐水冲洗后切成小块，置-70℃冰箱中冻存。

　　二、DNA提取

　　取约绿豆大小的组织制成匀浆，加适量5　mg/ml RNA酶、10%十二烷基硫酸钠、10　mg/ml蛋白酶K，37℃消化3～4　h ,按常规方法用酚、氯仿抽提3～4次，上清液加醋酸钠和预冷无水乙醇沉淀出DNA，4℃离心，三蒸水溶解沉淀，用紫外分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳，测算DNA浓度。

　　三、PCR引物及扩增条件

　　针对DCC基因201密码子合成一对引物：201-U　5′-GTCTTGCCCTCTGGAGCATTGCAGATCAGT-3′和201-D　5′-CTGAAGGCAACAAGAGCATTGC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司提供。取100～300　ng　DNA加入100　μl PCR反应体系：10　mmol/L　Tris HCl(pH8.0)、50　mmol/L　KCl、2　mmol/L　MgCl₂、100　mmol/L dNTPs、0.5　μmol/L引物、2.5　U Taq DNA聚合酶，在PCR(Perkin Elemer 2400)仪上操作，反应条件：94℃变性30　s，58℃退火1　min，72℃延伸30　s，循环35次。

　　四、限制性酶切多态性分析

　　取PCR扩增产物15～20　μl，用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀过夜，三蒸水溶解，加Sal Ⅰ酶，37℃消化3～4　h，消化后产物进行3%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙啶染色，紫外光下观察照像，根据条带分析突变情况。

　　五、资料分析及统计处理

　　参照临床及病理学资料，依据性别、年龄、癌灶部位、类型、浸润深度、淋巴结转移以及分化程度等因素，对照PCR检测的突变结果，行卡方检验。

　　结果

　　一、DCC基因201密码子突变检测结果

　　所有标本均扩增成功，酶切后显示126　bp与29　bp 2条带者为野生纯合子，显示155　bp 1条带者为突变纯合子，显示155　bp、126　bp、29　bp 3条带者为突变杂合子(图1)。大肠癌组织、癌旁粘膜、正常对照组突变率分别为71%、60%、33%。癌组织与癌旁粘膜的突变率差异无显著意义，但均明显高于正常对照组(P＜0.025，表1)。

　　1、8分别为正常大肠粘膜及癌旁大肠粘膜PCR产物；3、5为大肠癌组织PCR产物；2、4、6、9分别为1、3、5、8经Sal Ⅰ酶切后产物；7为分子量标准:PUC DNA/MSPⅠ

图1　PCR SalⅠ/RFLP分析大肠癌组织中DCC基因

　　201密码子突变琼脂糖电泳

表1　大肠癌和癌旁组织中结直肠癌缺陷基因

　　201密码子突变情况与正常大肠粘膜的比较

　　 注：^*正常对照组与大肠癌组织比较P＜0.05；^＃大肠癌旁粘膜与大肠癌组织比较P＞0.05

　　二、大肠癌DCC 基因201 密码子突变与其临床生物学因素的关系

　　根据突变检测结果，对照临床病理学资料分组，各组突变情况见表2。201密码子点突变在大肠癌合并淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（χ²=4.4178,P＜0.05）,依Dukes分期，Dukes C、D期突变率显著高于Dukes A、B期（χ²=7.1957,P＜0.005）。其它各参数组差异均无显著意义。

　　讨论

　　DCC基因第201号密码子是大肠癌的突变高发位点，Honsako等^［4］曾报道在大肠癌中其突变率为75%。为获得含该密码子扩增产物，我们设计的上游引物为第191～200密码子，由于选择了适宜的退火温度，尽管为产生酶切位点而故意使上游引物3′末端最后一个碱基错配，长155　bp的靶序列仍然被成功扩增，上游引物3′末端与野生型201密码子形成Sal　Ⅰ酶切位点G*TCGAC　3′，酶切后电泳可分为126bp和29bp 2个片段，如201密码子第一个碱基发生任何改变，则酶切位点破坏，切割困难，仍保留155bp片段。为排除155bp条带为未完全消化所致，我们将实验中已证实能完全消化的样本与之平行消化。研究结果显示大肠癌组织与相应癌旁正常粘膜201密码子总突变率分别为71%与60%，差异不明显，但均显著高于正常对照，分析癌与癌旁粘膜201密码子的纯合突变率则分别为40%与2.8%，差异有非常显著意义。在35例配对组织中，至少有17例(49%)大肠癌较癌旁粘膜新增一个突变。现代遗传学研究揭示，大肠癌的发生是多基因事件累积作用的结果。201密码子突变是大肠癌发生中的一个早期基因事件，大肠癌的易感性将随突变的发生而增高，结果提示201密码子突变是大肠癌高危人群的遗传标记，对大肠癌高危人群的筛选和早期诊断有重要意义。

表2　大肠癌临床病理学因素与结直肠癌缺陷基因

　　201密码子突变的关系

　　 DCC表达蛋白与神经细胞粘附分子高度同源，其功能是通过介导细胞间、细胞与基质间相互作用而影响细胞生长、分化、信号传递以及大肠癌的浸润和转移，DCC基因失活将导致细胞去调节性生长及细胞间及细胞与基质间的粘附力下降而获得转移能力。经地塞米松诱导能稳定表达DCC反义RNA的纤维母细胞生长速率增加，并对裸鼠具有致癌性。约50%～60%的大肠癌DCC表达失活，并与癌分期、转移呈明显相关^［5］。

　　DCC失活原因有点突变、插入突变、5′端纯合性丢失、过甲基化作用等等。位于DCC基因外显子Ⅲ的201密码子点突变较为受到关注，突变形式为CGA（精氨酸）→GGA（甘氨酸）^［6］。以往认为它是一个多态位点，但目前研究发现它是一个真正突变^［3］，它的突变影响了DCC转录、翻译或DCC蛋白的类粘附分子功能。

　　本组大肠癌标本检测显示伴淋巴结转移组和Dukes C、D期大肠癌201密码子突变率显著高于无淋巴结转移组和Dukes A、B期，这与Honsako等^［4］的研究报道相一致。提示201密码子突变与大肠癌转移有密切关系，在预测癌的转移潜能，评估预后，指导临床处理有重要意义。

　　向缺乏DCC表达的癌细胞转染正常的DCC基因或DCC全长cDNA，癌恶性程度明显得到遏止，并向好的分化方向发展^［7］，可见DCC的失活和复活与癌的转归有着直接的联系。DCC失活机制十分复杂，有关201密码子突变的研究开展不久，探索该突变在大肠癌发生发展中所起的作用，有助于我们从分子水平认识大肠癌发病机制。我们已合成了以DCC基因195～204密码子开放阅读区编码的多肽，用以制备以此为抗原的抗DCC蛋白单抗，以检测DCC蛋白的表达情况。这样也可能为大肠癌预后评估和高危人群筛选提供一个新的途径。 基金项目：江苏省科委自然科学基金资助(BJ 97005)

　　作者单位：吴文溪（南京医科大学第一附属医院普通外科，210009）

　　马利民（南京医科大学第一附属医院普通外科，210009）

　　参考文献

　　［1］Fearon ER , Cho KR, Nigro JM, et al. Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers. Science,1990,247:49-56.

　　［2］Goi T, Yamaguchi A, Nakagawara G, et al. Reduced expression of deleted colorectal carcinoma (DCC) protein in established colon cancers. Br J Cancer,1998,77:466-471.

　　［3］Schmitt CA,Thaler KR,Wittig BM, et al.Detection of the DCC gene product in nomal and malignant colorectal tissues and its relation to a codon 201 mutation.Br J Cancer,1998,77:588-594.

　　［4］Honsako Y,Aoyama N,Futami S, et al.Codon 201^GLY in DCC gene relates to invasive colorectal carcinoma and its distant metastasis. Gastroenterology,1994，106:A 394.

　　［5］胡大新，郭伟，宋少柏，等.大肠癌DCC基因mRNA表达的频发缺失. 中国实用外科杂志，1996，16：677-6788．

　　［6］Miyake S,Nagai K,Yoshino K,et al.Point mutations and allelic deletion of tumor suppressor gene DCC in human esophageal squamous cell carcinomars and their relation to metastasis.Cancer Res,1994,54:3007-3010.

　　［7］Tanaka K,Oshimura M,Kikuchi R,et al.Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18.Nature,1991,349: 340-342.