大肠癌、大肠腺瘤Cyclin d1、P16和PCNA蛋白表达及其意义
第三军医大学学报2000年第22卷第6期
阎晓初 柳凤轩 贺光友 于冬梅 王宗前
摘 要： 目的 探讨细胞周期调控因子蛋白表达在大肠癌发生发展中的作用及其对预后影响。方法 采用免疫组化染色对113例大肠癌、14例大肠腺瘤、11例腺瘤癌变组织中Cyclin d1、P16和PCNA进行了检测。结果 大肠癌、腺瘤和癌变Cyclin d1、P16以及PCNA阳性表达率与正常大肠粘膜相比均相差显著(P＜0.05)，腺瘤癌变Cyclin d1表达明显增高，大肠癌P16表达明显降低。大肠癌、腺瘤癌变的PCNA较腺瘤组显著增高(P＜0.01)。Cyclin d1、PCNA过度表达者，其5年生存率均显著降低。结论 Cyclin d1过度表达与P16基因突变失活可能加速细胞周期转化，促进大肠癌的发生；Cyclin d1过度表达在大肠癌早期形成过程中可能起一定作用。Cyclin D1、PCNA过度表达提示为大肠癌预后不良的危险因素。
关键词：大肠肿瘤；细胞周期；免疫组化；预后
近年来，有关细胞周期及其调控机制研究已取得了较大进展，且愈来愈多的证据表明，细胞周期调节失控是肿瘤发生发展的重要机制［1］。有关大肠肿瘤细胞周期调控因子表达的研究，文献［2～3］报道不多，细胞周期调控因子表达与大肠癌预后关系的研究报道甚少［4］，为此，本研究采用免疫组化方法对113例大肠癌的细胞周期调控因子Cyclin d1、P16和增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)进行检测，探讨细胞周期调控因子表达在大肠癌发生发展中的作用及对预后判断的意义。
1 材料与方法
1.1 标本 收集我院1987～1996年间手术切除的大肠癌113例，男54例，女59例；年龄20～83岁，平均年龄55.6岁。右半结肠50例；左半结肠63例。高分化腺癌33例，中分化腺癌58例，低分化腺癌22例。Dukes分期：A期22例，B期37例，C期41例，D期13例。所有病例均获得随访结果，随访时间20～87个月，平均45.6个月。同时选择正常大肠粘膜10例、大肠腺瘤14例(不典型增生Ⅰ级5例、Ⅱ级5例、Ⅲ级4例)和腺瘤癌变11例。所有标本经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，厚度3～5μm，行HE染色和免疫组化染色。
1.2 免疫组化染色
采用S-P法，第一抗体CyclinD1(1∶40)、P16(1∶40)和PCNA(1∶100)分别为美国SantoCruz和Zymed公司产品。S-P试剂盒系丹麦Dako公司产品。其中CyclinD1和P16进行微波抗原修复。每批染色均设立阳性和阴性对照。结果判定：根据阳性细胞所占视野面积的百分比和染色强度分别记为：(-)无明显阳性反应细胞，(+)阳性细胞的面积小于25%，着浅棕色；()阳性细胞面积大于25%，呈棕色或深棕色；PCNA采用计数标记指数(Labelingindex,LI)，即平均每100个细胞中PCNA阳性细胞数。
1.3 统计学处理 采用χ2检验，单因素方差分析和Kaplan-Meier生存率曲线分析及logrank检验。
2 结果
2.1 大肠癌中CyclinD1、P16和PCNA蛋白的表达 正常大肠粘膜、大肠腺瘤、腺瘤癌变和大肠癌细胞周期调控因子CyclinD1、P16和PCNA显示不同程度的表达，见表1。其中CyclinD1、PCNA以细胞核表达为主，P16主要为细胞浆着色，见图1、2。大肠癌、腺瘤和癌变CyclinD1、P16以及PCNA阳性表达率与正常大肠粘膜相比均相差显著(P＜0.05)，腺瘤癌变Cyclin d1表达明显增高，大肠癌P16表达明显降低。大肠癌、腺瘤癌变的PCNA lI较腺瘤组显著增高(P＜0.01)。大肠腺瘤随腺瘤不典型增生分级增加，Cyclin d1表达率和PCNA LI逐渐增高，而P16表达率逐渐降低。
表1 正常大肠、腺瘤、腺瘤癌变及大肠癌Cyclin d1、P16和PCNA表达
tab 1 Expression of Cyclin D1, P16 and PCNA in normal mucosa, adenoma,adenoma with malignant degeneration and carcinoma of large intestine
| Group |
Cases |
Cycin D1+(%) |
P16+(%) |
PCNA LI( ±s) |
| Normal mucosa |
10 |
1(10.00) |
8(80.00) |
22.34±6.57 |
| Adenoma |
14 |
8(57.14)▲ |
9(64.29) |
36.12±12.32▲ |
| Malignant deqeneration |
11 |
8(72.73)▲ |
7(63.64) |
47.74±17.29▲ |
| Carcinoma |
113 |
62(54.87)▲ |
52(46.02)▲ |
50.62±15.41▲ |
▲；P＜0.05 vs normal mucosa
图1 中分化腺癌癌组织Cyclin d1呈细胞核强阳性表达，癌旁粘膜呈阴性 (S-P×200)
fig 1 Strong positive expression of Cyclin D1 in cell nuclears of moderate-differentiated adenocarcinoma, negative expression of Cyclin D1 in mucosa adjacent to the carcinoma (S-P×200)
图2 中分化腺癌P16呈细胞浆阳性表达 (S-P×200)
fig 2 Positive expression of P16 in cytoplasm of moderate-differentiated adenocarcinoma (S-P×200)
本组113例大肠癌的Cyclin d1、P16表达以及PCNA LI在不同性别、年龄的患者间无明显差别；与肿瘤部位、大小、组织学类型以及Dukes分析亦无关。
2.2 Cyclin D1、P16表达与细胞增殖活性的关系，见表2
大肠腺瘤中Cyclin D1阳性与阴性病例的PCNA LI相接近，经统计学处理两组间差异均无显著性(P＞0.05)。腺瘤癌变中Cyclin d1阳性表达者PCNA LI显著高于阴性者(P＜0.05)，在大肠癌Cyclin D1阴性时，PCNA lI较低，Cylin D1阳性表达者，PCNA LI明显增高(P＜0.01)。大肠腺瘤、腺瘤癌变和大肠癌中P16阳性与阴性者间，PCNA lI相差不显著(P＞0.05)，但阳性表达者的PCNA指数均值偏低。
表2 大肠腺瘤、腺瘤癌变和大肠癌Cyclin d1、P16表达与PCNA LI比较
tab 2 Comparison of PCNA LI and expression of Cyclin D1 and P16 in adenoma,adenoma with malignant change and carcinoma of large intestine
| Histological type |
Cases |
PCNA LI(±s) |
| |
|
Cyclin D1- |
Cyclin D1+ |
P16- |
P16+ |
| Adenoma |
14 |
30.43±6.64 |
40.38±14.21 |
40.18±14.70 |
33.87±11.07 |
| Malignant change |
11 |
33.70±14.08 |
53.01±12.74* |
53.23±6.55 |
44.61±18.38 |
| carcinoma |
113 |
46.27±14.91 |
54.21±15.00* * |
52.34±14.45 |
48.62±16.38 |
*：P＜0.05,* *：P＜0.01 vs Cyclin D1-
2.3 大肠癌Cyclin D1、P16和PCNA表达与预后关系
本组大肠癌经随访观察，5年内死于本病者31例，占27.43%。Kaplan-Meier生存率曲线分析，CyclinD1强阳性、弱阳性和阴性表达者，5年生存率分别为47.75%、65.91%和67.39%，见图3，经Logrank检验，强阳性组5年生存率显著低于阴性组和弱阳性组(P＜0.05)。P16强阳性、弱阳性和阴性表达者，5年生存率较接近，分别为61.00%、70.42%和59.13%，3组间差异无显著性(P＞0.05)。从生存曲线看，P16阴性表达者预后相对较差。PCNA lI低者(≤40%)5年生存率为80.46%，PCNA LI高者(＞40%)5年生存率为59.21%，见图4，两组间差异显著(P＜0.05)。
图3 Cyclin D1表达与大肠癌预后的关系
fig 3 The relationship between the expression of Cyclin D1
and prognosis in large intestine carcimona
图4 PCNA标记阳性程度与大肠癌预后的关系
fig 4 The relationship between the PCNA LI and prognosisin large intestine
carcimona
3 讨论
细胞周期调控因子为一组调节细胞增殖、分化的正负信号，它们通过相互促进和抑制作用以维持细胞周期的正常进程。在恶性肿瘤细胞中，这些调控因子常发生突变或失活，致使正常调节紊乱，导致细胞周期进程加快，促进肿瘤形成与发展。Cyclin d在细胞周期中可与CDK结合，促进细胞周期进程，因而被视为一种原癌基因。而P16则抑制CDK的活性，阻止细胞周期的转化。研究发现Cyclin d1和P16与食管癌、肺癌和乳腺癌等肿瘤的发生发展有关［5～6］。而在大肠肿瘤报道不多，其结果亦不一致。Cyclin d1在大肠癌的阳性表达率为30%～60%，大肠腺瘤约为34%～83%不等，一些报告显示腺瘤阳性率低于癌，另一些则发现腺瘤检出率比腺癌高。而P16在大肠癌的检出情况差异很大，一般多低于正常大肠粘膜和腺瘤［8］。本组大肠癌Cyclin d1阳性率为54.87%，与大肠癌组织学类型、Dukes分期、大小、部位和患者性别、年龄等因素无显著相关性。在腺瘤和腺瘤癌变阳性率分别为57%和72%，无较大肠癌高，而在正常大肠粘膜仅有1例弱阳性表达，腺瘤中Cyclin D1表达，随不典型增生分级增加而增高，表明Cyclin d1过度表达在大肠癌早期形成过程中有可能起一定的作用。这与Arber等［9］的报道结果相吻合。P16在大肠癌表达率为46%，低于正常大肠粘膜、大肠腺瘤和癌变，且腺瘤中P16表达随不典型增生程度增加而减少。提示P16基因突变失活导致P16蛋白表达量减少。同时本实验还显示P16表达减少时，Cyclin d1表达增加，使其与CDK4结合增多，从而促进了细胞的增殖分裂，这可能是大肠癌发生的重要分子机制。
细胞周期的转化可反映细胞的分裂、增殖程度。有关细胞周期调控因子对肿瘤细胞增殖活性影响的研究，文献报道相对较少。本研究中，我们观测到大肠癌Cyclin d1阴性表达者，其PCNA标记指数较低，而阳性表达尤其是强阳性表达者，PCNA指数较阴性者显著增高(P＜0.05)。表明Cyclin d1过度表达可加速细胞进入S期，以促进大肠癌细胞不断分裂和增殖。P16蛋白阴性表达者，PCNA指数略高于阳性表达组，提示P16过度表达则可抑制Cyclin d1-CDK4的活性，减缓细胞G1→S期的转化，以阻止癌的发生和发展。
有关细胞周期调控因子与大肠癌预后关系的报道甚少。Cyclin d1作为细胞周期正调节因子，可促进肿瘤的发生与发展，本实验结果显示Cyclin d1不仅与大肠癌发生相关，而且对大肠癌预后也有一定的影响，我们通过生存曲线分析，发现Cyclin d1阳性表达，尤其是强阳性表达者，其3年、5年生存率显著低于阴性组。提示Cyclin d1蛋白过度表达患者预后较差。而P16蛋白阳性和阴性表达对大肠癌术后生存时间影响不大，两组3年、5年生存率比较接近(P＞0.05)。PCNA与恶性肿瘤预后的关系，多数观点认为PCNA表达增强者，其预后一般较差［10］。本研究结果显示PCNA标记指数高的大肠癌，其3年、5年生存率较PCNA指数低者显著降低，证实PCNA过度表达与大肠癌预后较差有关。
作者简介：阎晓初(1963-)，男，四川省苍溪县人，博士，副主任医师，副教授，主要从事大肠肿瘤、分子病理方面的研究，发表论文20余篇。电话：(023)68754212阎晓初（第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆400038)
柳凤轩（第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆400038)
贺光友（第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆400038)
于冬梅（第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆400038)
王宗前（第三军医大学附属西南医院病理学研究所，重庆400038）
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